王 楠，高曉霞，張愛榮，王佩義，秦雪梅＊＊

（1. 山西大學中醫(yī)藥現代研究中心 太原 030006；2. 山西大學化學化工學院 太原 030006；3. 山西廣譽遠國藥有限公司 太谷 030800）

定坤丹是由紅參、鹿茸、西紅花、三七、白芍、熟地黃、當歸、白術、枸杞子、黃芩、香附、茺蔚子、川芎、鹿角霜、阿膠、延胡索等藥味經加工制成的大蜜丸[1]?？勺萄a氣血，調經舒郁，用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經不調、行經腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、產后諸虛、骨蒸潮熱等癥狀，為治療婦科疾病的良方。相傳定坤丹始創(chuàng)于清代乾隆四年，為乾隆帝所賜名，原為“宮闈專用圣藥”，專供內廷使用。有學者認為定坤丹是據清時竹林寺僧《竹林女科證治》中的“補經湯”方加減而成，也有學者認為其是由《婦人大全良方》中的續(xù)嗣降生丹加減而成[2]，但其功用類似，現代研究中的臨床觀察實驗也證明了定坤丹可用于改善常見的痛經[3-5]、月經不調[6-8]、多囊卵巢綜合征[9,10,14]、圍絕經期綜合征[11]（更年期綜合征）、子宮內膜異位癥[12]等多種婦科疾病，還可以用于不孕不育[13,14]、產后、術后的疼痛緩解和身體調養(yǎng)調養(yǎng)[15]以及活血化瘀等情況的改善。另外，通過對其藥效指標和相關藥理機制的探索研究還發(fā)現定坤丹的治療作用可能與改善了卵巢和子宮器官中的性激素水平及部分生長因子的表達水平有關[16]，另外，定坤丹還可以增加子宮的血流灌注，從而改善其局部缺血情況，緩解患者的疼痛[5]。

定坤丹的組方十分復雜，藥味眾多，現行2015 版《中國藥典》規(guī)定定坤丹的質量控制標準包括：對枸杞子、白術、甘草的顯微性狀鑒別；對當歸、川芎、枸杞子、白芍、紅參、三七對照藥材以及芍藥苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對照品的薄層對照鑒別；含量測定項目中規(guī)定本品每丸含紅參和三七以人參皂苷Rg1計，不得少于3.0 mg[1]。其中定性鑒別需要多次實驗分別定性不同藥材及對照品，步驟繁多復雜，顯微鑒別對于蜜丸劑型也有一定的難點，另外現有的含量測定成分單一，僅限制了其中紅參及三七藥材的質量，對于藥味眾多的定坤丹復方并不能反映其質量全貌，因此目前藥典中收載的標準可控性較低。經文獻調研發(fā)現關于定坤丹質量的研究較少，多為薄層鑒別[17-18]和顯微鑒別[19]，且實驗研究的年限相對久遠，其中，較新的報道為張榮[18]對定坤丹中西紅花的薄層色譜研究，但也僅對其中一味西紅花藥材進行了限制。因此，目前定坤丹的質量研究還處于較為局限的現狀，仍有待進一步發(fā)展和探索。

中藥指紋圖譜技術是借由現代的分析手段如色譜、光譜等技術，對中藥進行較全面的表征，該手段得到的圖譜中多個成分的含量、比例和化合物出現的先后順序都是相對固定的，因此指紋圖譜的標準具有整體性和全面性的特點[20]，可以相對全面地表征復雜組分的整體質量。目前，藥典中已有三七總皂苷、丹參總酚酸提取物等中藥提取物以及清開靈注射液、夏桑菊顆粒、桂枝茯苓膠囊等中藥復方制劑收錄了對照指紋圖譜標準作為其質量控制的項目之一。

因此，為了從整體上綜合分析評價定坤丹，可利用指紋圖譜技術，綜合反映不同生產批次定坤丹的穩(wěn)定成分及主要成分差異，為其內在質量特征評價和等級分類提供科學依據。本文選用了應用廣泛的超高效液相色譜技術建立了一種適用于定坤丹質量控制的指紋圖譜檢測方法，以期更完整地表征定坤丹的整體質量。

1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜系統(tǒng)、Empower 工作站含四元梯度泵、自動進樣器、PDA檢測器（Waters 公司），超高效液相色譜與質譜聯(lián)用儀（Thermo Scientific Q Exactive UPLC-MS），美國Thermo公司Water Acquity UPLC?HSS T3 色譜柱，超聲清洗儀（KQ2200DB 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司），萬分之一天平（CPA225D 電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司）

定 坤 丹（ 批 號 ：139170643、139170644、139170645、 139170647、 139170648、 139170649、139170650、 139170651、 139170652、 139170653、139170654、 139170655、 139170656、 139170657、139170658、 139170659、 139170661、 139170662、139170663，由山西廣譽遠國藥集團有限公司提供）；沒食子酸（批號：20161220）、5-羥甲基糠醛（批號：20170322）、芍藥內酯苷（批號：20170110）、芍藥苷（批號：20170115）、阿魏酸（批號：20170401）、甘草苷（批號：20161201）、黃芩苷（批號：20170515）、藁本內酯（批號：20170312）標準品，均購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，超純水由Milli-Q Integral Water Purification System（美國Millipore 公司）制備；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

稱取定坤丹大蜜丸約1.00 g，精密稱定，加等量硅藻土研磨成粉末后，轉移至錐形瓶中加甲醇50 mL 超聲提取30 min，提取液過濾，旋轉蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，加入甲醇定容至10 ml，過0.22 μm 微孔濾膜濾過，轉移至液相小瓶，作為供試品溶液備用。

2.2 對照品溶液制備

取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、芍藥內酯苷、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、黃芩苷、藁本內酯對照品適量，精密稱定，分別置容量瓶中，加甲醇制成濃度分別為1 mg·mL-1（沒食子酸），0.1 mg·mL-1（5-羥甲基糠醛），0.596 mg·mL-1（芍 藥 內 酯 苷），0.629 mg·mL-1（芍 藥苷），0.118 mg·mL-1（阿魏酸），1.002 mg·mL-1（甘草苷），1.001 mg·mL-1（黃芩苷），4 mg·mL-1（藁本內酯）的對照品溶液。

2.3 色譜條件

Water Acquity UPLC?HSS T3 色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8μm），流動相：A-0.1%甲酸水；B-0.1%甲酸甲醇，梯度洗脫：0-5 min，2%-7%B；5-16 min，7%-44%B；16-17.5 min，44%B；17.5-38min，44%-85%B；38-41 min，85%-95%B，41-45 min，95%-2%B。檢測波長：全波長掃描，流速：0.2 mL·min-1，柱溫：30°C，進樣量：5μL。

樣本檢測后首先得到全波長3D 指紋圖譜（見圖1），經過色譜峰對比以及峰個數、響應值的分析，發(fā)現280 nm 處圖譜（見圖2）基線平穩(wěn)，峰個數較多，因此選擇280 nm 作為指紋圖譜的檢測波長，其中出峰穩(wěn)定、峰面積較大且相應較高的S 峰（見圖2）可以作為基準參照峰，以進行指紋圖譜的分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察

圖1 定坤丹全波長3D指紋圖譜（批號：139170647）

圖2 定坤丹280 nm紫外波長下的指紋圖譜（批號：139170647）

取S4 號樣品按照2.1 項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，以S 峰（見圖2）作為基準峰，測得各共有峰相對峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在3%以內且各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.5%；將6 次進樣圖譜導入國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008版）軟件進行處理，與對照圖譜相似度均＞0.99，表明精密度良好。

2.4.2 重復性考察

分別取S4 號樣品6 份，按照2.1 項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣分析，以S 峰（見圖2）作為基準峰，測得各共有峰相對峰面積RSD 在3%以內且各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.5%；將6 份樣品圖譜導入國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008 版）軟件進行處理，與對照圖譜相似度均＞0.99，表明重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取S4 號樣品按照2.1 項下方法制備供試品溶液1份，分別在制備后0，2，4，6，8，10，12，24 h 進樣檢測，以S 峰（圖2）作為基準峰，測得各共有峰相對峰面積RSD 在3%以內，且各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.5%；將6次進樣圖譜導入國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008版）軟件進行處理，與對照圖譜相似度均＞0.99，表明穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測定與指紋圖譜結果

2.5.1 樣品測定與共有峰的標定

圖3 19批定坤丹UPLC指紋圖譜

圖4 定坤丹UPLC對照指紋圖譜

取19批定坤丹樣品按照2.1項下方法制備成供試品溶液，于2.2項色譜條件下進行分析，得到19批次復方的UPLC 指紋圖譜疊加圖（圖3）。以上述19 批次樣品的色譜譜圖為基礎，使用藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008 版）進行數據處理，其中S4(139170647)批次樣品的色譜峰分離度和峰形較好，基線平整，因此選擇該樣品圖譜作為參照指紋圖譜。為防止極端數據對分析結果的影響，選擇平均數法作為對照指紋圖譜的生成方法，使用多點校正的方法對色譜峰進行全譜峰匹配，處理得到共有模式特征圖譜，即為定坤丹對照特征圖譜R（見圖4）。

根據得到的指紋圖譜結果，選擇圖譜中含量較高且分離度較好的色譜峰作為共有峰，共標定出22個共有峰并將其作為定坤丹的指紋圖譜共有峰。

2.5.2 相似度的計算

將得到的19 批復方的UPLC 指紋圖譜全部導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008 版），生成對照指紋圖譜，并計算各批次樣品與標準對照圖譜之間的相似度，相似度結果見表2，全譜峰匹配結果表明19 批次定坤丹與對照圖譜間的相似度均大于0.91，表明這19批次定坤丹質量較為均一穩(wěn)定。

2.5.3 化學成分的指認

本研究采用對照品和液質聯(lián)用技術對各共有色譜峰進行了化學成分的指認，經過保留時間、紫外光譜及質譜碎片信息進行比對，最終確認了其中8 個色譜峰，其中1 號峰為沒食子酸，2 號峰為5-羥甲基糠醛，3 號峰為芍藥內酯苷，4 號峰為芍藥苷，5 號峰為阿魏酸，6 號峰為甘草苷，10 號峰為黃芩苷，基準峰S 即18號峰為藁本內酯，對照品圖譜見圖4，其質譜碎片信息結果見表1。

表1 定坤丹指紋圖譜相似度評價結果

3 討論

在考察定坤丹備樣條件時，對比了超聲及回流提取2種提取方法，發(fā)現色譜結果基本無差異，因此選擇操作相對簡便的超聲提取法；同時還考察了不同提取溶劑（甲醇，50%甲醇，水）對其成分檢測的影響，各提取物檢測后以色譜峰個數及峰面積等因素作比較，最終選擇了峰個數較多、整體響應較高的甲醇提取物作為供試品溶液；另外在檢測波長的選擇方面，采用紫外檢測器在190-400 nm 范圍內全波長掃描供試品溶液，經對比發(fā)現在280 nm 下樣品溶液色譜峰相對較多且基線平穩(wěn)，峰型良好，故最終選擇了280 nm 作為檢測波長。

廣譽遠國藥有限公司為本實驗提供了19 批次定坤丹，通過對樣本的檢測和相似度等結果分析，表明這19 批次定坤丹大蜜丸相似度較高，沒有明顯差異，反映了廣譽遠公司在生產定坤丹時的原料投入、制作工藝及廠房條件等方面都比較穩(wěn)定，可以保證所生產藥品的穩(wěn)定和均一。

圖5 對照品圖譜

表2 定坤丹中鑒定出的8個化合物的UPLC-MS精確相對分子量測定結果

經前期文獻調研發(fā)現，目前對于定坤丹的研究主要集中于臨床觀察實驗和藥效實驗部分，但對于定坤丹的成分和質量研究方面還處于相對空白的狀態(tài)。對藥效及臨床作用的深入探索可以作為指導定坤丹臨床應用的科學依據，但無法對定坤丹復方本身的質量進行良好的控制，因此，建立適用于定坤丹復方的質量控制標準，可以進一步保證其藥效和臨床作用的發(fā)揮。因此，本研究從質量控制方面出發(fā)，首次采用UPLC 的技術建立了定坤丹指紋圖譜，該方法可行性強，且能較為全面地反映定坤丹的化學組成，為其內在的質量評價提供了高效和簡便的方法。本實驗還對定坤丹中的22個共有峰進行了指認，經過與對照品對比及UPLC-MS 聯(lián)用的分析，鑒定了其中8 個共有峰，為其進一步的體內外化學成分研究提供了參考。

另外，對上述指認得到的8個成分進行調研發(fā)現，其中5-羥甲基糠醛可能是熟地黃中具有治療貧血作用的藥效物質基礎成分之一[21]，Hideale 等[22]還發(fā)現了5-羥甲基糠醛在臨床試驗中可以提高大鼠紅細胞的變形能力，同時還可以改善其血液流變學的指標。另外，來源于白芍藥材中的芍藥內酯苷和芍藥苷對血虛模型的小鼠進行給藥，試驗發(fā)現它們對血液中的紅細胞和血紅蛋白均具有顯著的提升作用，表明芍藥苷和芍藥內酯苷良好的補血作用[23]。當歸、川芎藥材中的阿魏酸，在體內外試驗中均表現出了對各種誘導劑引起的血小板聚集與釋放的抑制作用[24]。而藁本內酯對平滑肌有顯著的松弛作用[25]，還可以非特異性地抑制子宮的自發(fā)節(jié)律性收縮[26]，這提示了藁本內酯可能具有改善痛經的生物活性，通過抑制子宮收縮緩解患者的疼痛癥狀。這些已有實驗研究報道的活性成分可能對定坤丹整方的“補氣血”作用有一定的貢獻，這提示了這些成分可以作為定坤丹進一步的藥效物質基礎研究的科學參考。

另外，從本研究中可以發(fā)現，上述成分便于檢測，含量也相對較高，并且有良好的生物活性的報道，這些特點也為定坤丹的質量控制提供了進一步的研究思路?？梢越Y合Q-markers[27]的研究理念，從檢測、鑒定成分出發(fā)，進一步對這些穩(wěn)定存在且含量較高的成分進行分析，并對其中具有的藥理作用進行實驗研究和文獻調研，篩選后得到潛在的藥效成分，進而選擇同時穩(wěn)定存在、便于檢測且具有良好藥效貢獻的成分作為質量標志物，并進一步控制其含量，以期更科學、全面地對定坤丹進行質量控制。