楊雅蛟，孔維軍，孫 蘭，孫桂波，周立東，孫曉波

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 北京 100193）

四磨湯最早記載于《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》，由檳榔、木香、枳殼和烏藥組成，主要用于治療七情傷感、上氣喘息、胸膈滿(mǎn)悶、不思飲食等癥[1]，臨床治療胃腸道動(dòng)力不足、手術(shù)后胃腸功能障礙及胃癱[2]、嬰幼兒乳食內(nèi)滯證和中老年氣滯食積癥[3]。有文獻(xiàn)記載四磨湯口服液用于治療新生兒黃疸、功能性消化不良、胃食管返流等癥狀[4-7]。作為四磨湯的主要組成藥味，檳榔是棕櫚科植物檳榔Areca catechu L.的干燥成熟種子。春末至秋初采收成熟果實(shí)，水煮后干燥，除去果皮，取出種子，干燥即得?？?，辛，溫，歸胃、大腸經(jīng)，有殺蟲(chóng)、消積、行氣、利水和截瘧的功效[8]。傳統(tǒng)使用時(shí)，無(wú)毒性記載。海南等地有咀嚼鮮檳榔果實(shí)的習(xí)慣，但是長(zhǎng)期咀嚼易引發(fā)口腔癌癥。有研究認(rèn)為檳榔堿有潛在致癌活性[9]。2003 年，檳榔被世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）認(rèn)定為一級(jí)致癌物。中醫(yī)臨床上長(zhǎng)期使用含檳榔的復(fù)方制劑，但鮮見(jiàn)引起毒副作用的報(bào)道。

檳榔堿、新弗林、去甲異爾定、柚皮苷為四磨湯的主要活性成分[10]，而國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)四磨湯中柚皮苷進(jìn)行了HPLC 測(cè)定[11]，并未涉及其它成分。四磨湯中檳榔生物堿類(lèi)成分是其潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。檳榔堿是檳榔含量最高的生物堿，其次是檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿。為此，本文建立了靈敏準(zhǔn)確的HPLC 方法，同時(shí)測(cè)定四磨湯中4 種檳榔生物堿的含量，為其質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試劑

Waters 高效液相色譜系統(tǒng)，包括Waters 996 型紫外檢測(cè)器、Waters 600型四元泵、Waters 2695型自動(dòng)進(jìn)樣器和Waters Empower 2 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；JM-A30001 型電子天平（余姚紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司），KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），PB-10 型pH 計(jì)（德國(guó)Sartorius），N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司），DLSB-5/20型低溫冷卻循環(huán)（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），RCT 型磁力攪拌器（IKA），AF-7A 型手提紫外檢測(cè)燈（上海寶山顧村電光儀器廠），GP110-230 型無(wú)油隔膜泵（美國(guó)New Ipswich）。

氫溴酸檳榔堿（Ark，批號(hào)WG0114638-84239），1-氯乙基氯甲酸酯（Alfa，批號(hào)5002V13P），無(wú)水乙醚（分析純，北京化工廠，批號(hào)20160118），無(wú)水碳酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170906），二氯甲烷（分析純，北京化工廠，批號(hào)20160902），1,2-二氯乙烷（分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司，批號(hào)20171215），石油醚（分析純，北京化工廠，批號(hào)20170216），乙酸乙酯（分析純，北京化工廠，批號(hào)20171208），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司，批號(hào)106246），哇哈哈純凈水（批號(hào)201707173103GH），磷酸（HPLC級(jí)，Dikma 公司，批號(hào)5492278），三乙胺（HPLC 級(jí)，Dikma 公司，批號(hào)4048217），四磨湯樣品（湖南漢森制藥股份有限公司，批號(hào)161201），檳榔樣品（湖南漢森制藥股份有限公司，批號(hào)161203），去甲基檳榔次堿（Sigma，批號(hào)040M4741V，純度99.4%），鹽酸檳榔次堿（Alfa Aesar，批號(hào)10114762，純度99.8%），鹽酸去甲基檳榔堿（自制，純度99.1%），氫溴酸檳榔堿（美國(guó)ChromaDex，批號(hào)00001691-73F，純度99.7%）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：陽(yáng)離子Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm ×250 mm,5μm）柱；流動(dòng)相：乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH 至2.40）= 45:55，流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10.0μL（供試品），5.0μL（對(duì)照品）。

2.2 供試樣品溶液的制備

湖南漢森制藥股份有限公司提供含檳榔、烏藥、枳殼、木香的四磨湯樣品和按照公司方法制備的僅含檳榔的檳榔樣品。

分別精密量取0.5 mL 樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得各供試品，待用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

2.3.1 鹽酸去甲基檳榔堿的實(shí)驗(yàn)室制備

稱(chēng)取1.023 g 氫溴酸檳榔堿置于錐形瓶中，加5 mL水，用飽和碳酸鈉調(diào)至pH=13.0，加入50 mL 無(wú)水乙醚萃取3次，合并乙醚液，旋蒸至干，即得檳榔堿（413 mg）。

稱(chēng)取140 mg 檳榔堿，置50 mL 錐形瓶中，加3 mL二氯甲烷、0.12 mL 1-氯乙基氯甲酸酯和5 mL 1,2-二氯乙烷于0℃攪拌15 min，然后于100℃加熱回流6 h至反應(yīng)完全[薄層色譜TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，以石油醚:乙酸乙酯（2∶3）為展開(kāi)劑，高錳酸鉀顯色]，蒸干反應(yīng)液，得黃色油狀物（180 mg），用少量石油醚溶解，以樣品與硅膠1∶30 比例裝柱，以乙酸乙酯:石油醚（3∶2）洗脫，收集產(chǎn)物并蒸干（150 mg），加5 mL 甲醇110℃回流6 h 至反應(yīng)完全[TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，以石油醚:乙酸乙酯（2∶3）為展開(kāi)劑，高錳酸鉀顯色]，蒸干得到終產(chǎn)物即為鹽酸去甲基檳榔堿（101 mg）。氫溴酸檳榔堿與鹽酸去甲基檳榔堿的核磁共振氫譜（hydrogen nuclear magnetic resonance，HNMR）譜圖，見(jiàn)圖1。

從圖1 可以看出，與氫溴酸檳榔堿的HNMR 圖對(duì)比，鹽酸去甲基檳榔堿的HNMR 圖中缺少一個(gè)甲基，多一個(gè)氨基氫，與文獻(xiàn)報(bào)道的鹽酸去甲基檳榔堿數(shù)據(jù)相符合[12]，表明鹽酸去甲基檳榔堿已成功制備，用高效液相歸一法測(cè)得純度為99.1%。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取15.0 mg 去甲基檳榔次堿、25.0 mg 鹽酸檳榔次堿、10.0 mg 鹽酸去甲基檳榔堿和25.0 mg氫溴酸檳榔堿對(duì)照品至25 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取2 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液置于10 mL 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含119.28 μg·mL-1去甲基檳榔次堿、199.60μg·mL-1鹽酸檳榔次堿、79.28μg·mL-1鹽酸去甲基檳榔堿和199.40μg·mL-1氫溴酸檳榔堿的混合對(duì)照品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

圖1 氫溴酸檳榔堿(A)與鹽酸去甲基檳榔堿(B)的HNMR譜圖對(duì)比

分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL混合對(duì)照品溶液至2 mL 容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，制成6 個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程分別為：去甲基檳榔次堿Y=3.83×106X-4.68×104（R2=0.999），LOD為0.16 μg·mL-1，定 量 限（limit of quantitation，LOQ）為0.54μg·mL-1；鹽酸檳榔次堿Y=3.36×106X+1.17×104（R2=0.999），LOD 為0.12μg·mL-1，LOQ 為0.38μg·mL-1；鹽酸去甲基檳榔堿Y = 4.20 × 106X + 2.87 × 104（R2=0.999），LOD 為0.01 μg·mL-1，LOQ 為0.03 μg·mL-1；氫溴酸檳榔堿Y = 2.47 × 106X - 8.71 × 104（R2= 0.999），LOD 為0.47 μg·mL-1，LOQ 為1.56 μg·mL-1。結(jié)果 表明，去甲基檳榔次堿、鹽酸檳榔次堿、鹽酸去甲基檳榔堿和氫溴酸檳榔堿分別在11.94-95.42、19.96-159.68、7.928-63.424、19.94-159.52 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表1 4種生物堿的加樣回收率考察（n = 9）

3.1.2 精密度考察

取“2.3.2”的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得去甲基檳榔次堿、鹽酸檳榔次堿、鹽酸去甲基檳榔堿和氫溴酸檳榔堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n = 6）分別為0.6%、0.6%、0.8%和0.7%，保留時(shí)間的RSD（n = 6）分別為0.8%、0.5%、1.0%和0.9%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性考察

按“2.2”制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得四磨湯樣品中去甲基檳榔次堿、鹽酸檳榔次堿、鹽酸去甲基檳榔堿和氫溴酸檳榔堿含量的RSD（n = 6）分別為0.8%、0.9%、1.0%和0.8%，保留時(shí)間的RSD（n = 6）分別為1.1%、0.5%、0.8%和0.8%，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得四磨湯樣品中去甲基檳榔次堿、鹽酸檳榔次堿、鹽酸去甲基檳榔堿和氫溴酸檳榔堿含量的RSD（n = 6）分別為1.1%、0.8%、1.2%和0.9%，保留時(shí)間的RSD（n = 6）分別為0.8%、0.6%、1.0%和0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.5 加樣回收率考察

精密吸取9 份已知4 種生物堿含量的四磨湯樣品，每份0.5 mL，置于10 mL 容量瓶中，每3 份為一組，每組中按樣品溶液中相應(yīng)成分含量的80%、100%、120%加入對(duì)照品溶液，按“2.2”制備供試品試液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，四磨湯樣品中去甲基檳榔次堿、鹽酸檳榔次堿、鹽酸去甲基檳榔堿和氫溴酸檳榔堿的平均加樣回收率分別是101.04%、101.263%、103.45% 和98.43%，RSD（n = 9）分別為2.0%、1.1%、1.8%和0.9%。

3.2 樣品測(cè)定

將制備的四磨湯和檳榔樣品溶液按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得的4種生物堿對(duì)照品及四磨湯和檳榔樣品的HPLC圖譜見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在優(yōu)化的色譜條件下，4個(gè)成分得到較好的分離，峰形較好，滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

檳榔樣品只含有檳榔次堿、檳榔堿、去甲基檳榔堿和去甲基檳榔次堿等成分，而實(shí)際購(gòu)買(mǎi)到的對(duì)照品為檳榔次堿、檳榔堿、去甲基檳榔堿的鹽酸鹽或氫溴酸鹽，因此，實(shí)驗(yàn)中以177.63 mg 鹽酸檳榔次堿相當(dāng)于141.18 mg 檳榔次堿、236.25 mg 氫溴酸檳榔堿相當(dāng)于155.19 mg 檳榔堿、177.64 mg 鹽酸去甲基檳榔堿相當(dāng)于141.19 mg 去甲基檳榔堿進(jìn)行換算后，計(jì)算四磨湯和檳榔液樣品中各生物堿成分的含量，見(jiàn)表2。

含量測(cè)定結(jié)果表明，四磨湯中去甲基檳榔次堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿和檳榔堿的平均含量分別為0.039 3、0.059 0、0.002 5、0.088 8 mg·mL-1；檳榔樣品中去甲基檳榔次堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿和檳榔堿的平均含量為0.081 5、0.070 6、0.009 4、0.070 6 mg·mL-1。6份四磨湯樣品中去甲基檳榔次堿和檳榔次堿含量波動(dòng)比較大，6 份檳榔樣品中檳榔次堿和去甲基檳榔堿的含量波動(dòng)比較大，可能與樣品中檳榔藥材的采集地和采集時(shí)間等因素有關(guān)。此外，檳榔樣品中的檳榔堿含量低于四磨湯樣品，而檳榔樣品中去甲基檳榔次堿、檳榔次堿和去甲基檳榔堿的含量均高于四磨湯樣品，這可能與生物堿成分本身的性質(zhì)、加工和樣品制備環(huán)節(jié)對(duì)成分的影響有關(guān)。

圖2 四磨湯（A）、檳榔樣品（B）及對(duì)照品溶液（C）的HPLC圖譜

檳榔和四磨湯樣品中檳榔堿的含量均符合《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》（2015版）的規(guī)定（不得低于0.2%）[8]，但是未有去甲基檳榔次堿、檳榔次堿和去甲基檳榔堿的含量規(guī)定和要求。

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

4.1.1 色譜柱的選擇

4 種檳榔生物堿屬于小分子化合物，極性很強(qiáng)，在常規(guī)反相色譜柱上的保留較弱，色譜柱的選擇對(duì)4 個(gè)化合物的分離和準(zhǔn)確測(cè)定至關(guān)重要。本研究中，我們比較了klomasil 100-5 C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）柱、Tnature C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）柱、Lichocart C18（4.6×250 mm,5μm）柱、Agilent Ertend-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）柱 和Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm ×250 mm,5μm）柱等不同類(lèi)型色譜柱的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm×250 mm,5μm）色譜柱對(duì)4 個(gè)生物堿成分的分離效果和峰形均較好。

表2 樣品中4種生物堿含量(mg·mL-1)測(cè)定結(jié)果

4.1.2 流動(dòng)相pH值的影響

4 種檳榔生物堿色譜峰分離度受基質(zhì)溶液pH 的影響較大，去甲基檳榔堿在堿性條件下會(huì)水解成去甲基檳榔次堿，因此流動(dòng)相應(yīng)選用酸性條件。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相pH 值為1.90-3.00 時(shí)，4 個(gè)化合物的分離度較好，且pH 值越小，分離度越高，但同時(shí)對(duì)色譜柱造成損害，最終選定流動(dòng)相pH為2.40。

4.1.3 流動(dòng)相比例的選擇

流動(dòng)相的組成及比例關(guān)系也會(huì)影響4個(gè)生物堿化合物的分離效果。實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試并比較了乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH=2.40）=50∶50、乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH = 2.40）= 55∶45、乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH = 2.40）= 45∶55 三個(gè)流動(dòng)相組成的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH =2.40）= 50∶50 為流動(dòng)相時(shí)，去甲基檳榔次堿和檳榔次堿未能得到分離；以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH =2.40）=55∶45 為流動(dòng)相時(shí)，去甲基檳榔次堿和檳榔次堿不能完全分離；以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH =2.40）=45∶55 為流動(dòng)相時(shí)，去甲基檳榔次堿和檳榔次堿能得到較好的分離，因此以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺調(diào)pH=2.40）=45∶55 為流動(dòng)相時(shí)，4 個(gè)化合物均能得到較好的分離和較高的靈敏度。

4.2 方法優(yōu)勢(shì)和展望

由于鹽酸去甲基檳榔堿對(duì)照品在市面上較難買(mǎi)到，實(shí)驗(yàn)中我們根據(jù)文獻(xiàn)操作制備了鹽酸去甲基檳榔堿，純度為99.1%，能達(dá)到檢測(cè)的要求。

優(yōu)化的HPLC-DAD 方法能實(shí)現(xiàn)4 種生物堿的高效分離，且線(xiàn)性范圍寬、分析速度快、精密度高和穩(wěn)定性好，不僅可用于四磨湯中生物堿成分的含量測(cè)定，還可作為檳榔及其他含檳榔復(fù)方的相關(guān)生物堿成分含量測(cè)定的參考。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)方法學(xué)對(duì)4種檳榔生物堿進(jìn)行了含量測(cè)定，在檳榔安全性評(píng)價(jià)中，研究最多的是檳榔堿，而檳榔次堿、去甲基檳榔堿和去甲基檳榔次堿的毒性并未有報(bào)道。周緒正等[13]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿對(duì)小鼠口服最小致死量為370 mg·kg-1，最大耐受量為70 mg·kg-1，屬于中低毒范疇。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得漢森四磨湯口服液中檳榔堿平均含量在0.088 8 mg·mL-1，成人用量為每次20 mL，每日3次，每日檳榔堿攝入量約為5.328 mg，成年人的體重按50 kg 計(jì)算，檳榔堿攝入含量為0.047 16 mg·kg-1，比最小致死量低很多。因此，漢森四磨湯口服液檳榔含量達(dá)到安全指標(biāo)，但出于安全考慮，不建議長(zhǎng)期服用。