周鑫悅，張詩琪，林 露，陳 莉，李 琦，賴 昕，余麗雙

（福建中醫(yī)藥大學藥學院 福州 350122）

地龍又名蚯蚓，為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)，通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen，威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmil(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥體，相傳因用其治療宋太祖趙匡胤的帶狀皰疹和哮喘而得名“地龍”，是一種傳統(tǒng)的中藥材。地龍性寒味咸，具有降壓、平喘、通絡(luò)、利尿、解熱鎮(zhèn)痛抗炎等多種功效[1-2]且應(yīng)用廣泛，近年來常用于中藥制劑、注射劑及保健品中。地龍富含蛋白質(zhì)和多肽，干體中含量高達56%-66%[3]，地龍多肽種類繁多，功能各異。據(jù)報道，目前已從地龍中分離得到抗菌肽[4-6]、催產(chǎn)素相關(guān)肽[7]、鎮(zhèn)痛抗炎肽[8]等多種多肽，例如地龍多肽Annectocin 是從赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）中分離得到的一種催產(chǎn)素- 加壓素相關(guān)肽（oxytocin-vasopressin-related peptide），具有增強腸道的自發(fā)收縮、腎臟的脈動收縮及膀胱搖動，誘導(dǎo)產(chǎn)生陳規(guī)定型產(chǎn)卵行為的作用[7-9]；PTP是一種從蚯蚓全身中分離出的對前腸的自發(fā)性收縮顯示出強烈興奮作用的多肽[10]；F-1 和OEP3121 是從蚯蚓中純化出的有抗菌作用的抗菌短肽[5，6]。AQ-5、VQ-5 是從赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）的體腔液中分離得到的兩種新的鎮(zhèn)痛抗炎肽[8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，地龍多肽具有抗菌抗炎[5-6,8]、調(diào)節(jié)免疫[11]、降血脂血壓[12-13]等多種生物活性，因此有必要對地龍多肽進行研究測定。

目前分離檢測多肽最常用的方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）。高效液相色譜分辨率較高，常用于多肽的純度鑒定及純化。多肽分離分析常用的高效液相色譜法有：反相高效液相色譜法、離子交換色譜、體積排擠色譜、疏水作用色譜、親和色譜、多維高效液相色譜、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等[14]。舒一梅等[15]采用制備型反相高效液相色譜（RP-HPLC），使用A 液：5%乙腈（含0.05%TFA），B 液：95%乙腈（含0.05%TFA）為流動相，對離子交換層析分離后的豬股骨中的高活性組分進一步分離。劉佳佳等[16]采用A 液：0.1%甲酸和B 液：0.1%甲酸乙腈作為流動相，進行梯度洗脫，建立了牛奶中桿菌肽、粘桿菌素A、粘桿菌素B、維吉尼霉素和萬古霉素5 種多肽類抗生素的反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法，并對實際牛奶樣品進行了檢測，重復(fù)性良好。胡朝暾等[17]采用高效液相色譜-質(zhì)譜考察家福捕鳥蛛粗毒中的多肽和蛋白質(zhì)的多樣性，分離得到40多個色譜峰，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到238個多肽。

毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。毛細管電泳兼有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點，克服經(jīng)典色譜分辨率低、柱效低等缺陷[18-19]。隨著毛細管電泳的不斷發(fā)展，毛細管電泳越來越多地應(yīng)用到小分子多肽的分離分析中。分離多肽常用的毛細管電泳模式有：毛細管區(qū)帶電泳（CZE）和毛細管膠束電動色譜（MEKC）等。與高效液相色譜相比，毛細管電泳具有分析時間短，分離效果好，樣品用量少，有機試劑用量少，綠色環(huán)保，水相分離模式多，非常適合分離極性較大的成分等優(yōu)點。例如陳均志等[20]用高效毛細管電泳（HPCE）無膠篩分方式（MEKC）成功地分離和檢測了微波復(fù)合酶法大豆蛋白水解物中的多肽。王辰等[21]利用高效毛細管電泳法分析了腦蛋白水解物中的多肽組分且可有效地分析比較注射液中腦蛋白水解物的多肽組分。薛洪寶等[22]用毛細管電泳法直接同時定量了15 種氨基酸及2 種多肽，經(jīng)方法學驗證，其線性范圍寬、相對標準偏差低、精密度高、重現(xiàn)性好，且應(yīng)用于玉米幼苗樣品中氨基酸和多肽的定量，獲得滿意結(jié)果。

查閱相關(guān)文獻，未見任何分離檢測地龍多肽的報道。本論文根據(jù)地龍化學成分鑒定及藥理研究等相關(guān)文獻，選取六種具有生物活性且有較強紫外吸收的地龍多肽（即Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1 和AQ-5）進行分離測定。因上述地龍多肽多數(shù)均為小分子多肽，極性較大，前期實驗采用HPLC 無法同時分離多種地龍多肽。本實驗發(fā)現(xiàn)采用毛細管區(qū)帶電泳法可在10 min 內(nèi)快速同時分離檢測六種地龍多肽。但由于地龍多肽穩(wěn)定性較差，文獻報道提取上述地龍多肽需要采用地龍鮮品在低溫環(huán)境下提取或采用活地龍電針刺激其產(chǎn)生體液[8,23]，由于實驗條件限制，未能將該方法用于實際藥材中對地龍多肽的測定。但將其用于人加標尿樣的測定，回收率良好，表明該方法有望用于復(fù)雜樣品體系中地龍多肽的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ 型毛細管電泳儀（Beckman Coulter公司，美國），配以二極管陣列檢測器及32Karat軟件；戴安UltiMate3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；彈性未涂層石英毛細管（75 μm × 60 cm，有效長度49.5 cm，永年縣銳灃色譜器件有限公司），KQ-2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），雷磁PHS-3C 型酸度計（上海儀電科學儀器有限公司），XS105電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）。

六 種 多 肽Annectocin（CFVRNCPYG-NH2）、PTP（GFRDGSADRISHGF-amide） 、VQ-5 （VSSVQ） 、OEP3121（ACSAG）、F-1（Ac-AMVSS）和 AQ-5（AMADQ）對照品均購自上海吉爾生化有限公司（純度98%）；乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），二水合磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），十二水合磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，德國Merck 公司），甲酸（分析純，西隴科學股份有限公司），硼酸（分析純，西隴科學股份有限公司）、十水合四硼酸鈉（分析純，西隴科學股份有限公司），鹽酸（分析純，西隴科學股份有限公司），所有實驗用水為Milli-Q超純水。

尿液來源于實驗室成年健康志愿者在未服用任何藥物的前提下所取得的空白尿液。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取6 種地龍多肽標準品1 mg 至1 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，即得，六種地龍多肽濃度均為1 mg·mL-1。

1.2.2 樣品處理

將人尿樣品過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液。向人尿樣品續(xù)濾液中加入對照品Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5，使這六種多肽的濃度均達到80 ug·mL-1。

1.2.3 電泳條件

新毛細管使用前分別用水，0.1 mol·L-1HCl 溶液，水，0.1 mol·L-1NaOH 溶液，水各沖洗20 min；舊毛細管使用前分別用水，0.1 mol·L-1NaOH 溶液，水，運行緩沖液各沖洗8 min。

未涂層毛細管：75 μm × 60 cm（有效長度為49.5 cm）；運行電壓是20 kV，檢測波長是215 nm，壓力進樣3.45 kPa×10 s，操作溫度為25℃；每次進樣前，需運行超純水沖洗3 min，0.1 mol·L-1NaOH 溶液沖洗3 min，緩沖溶液沖洗3 min。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（1:99）；檢測波長：215 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：10μL；柱溫：25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離方法的選擇

分離檢測多肽最常用的方法有高效液相色譜法和毛細管電泳法，首先對分離方法進行選擇；在預(yù)實驗中，先嘗試使用高效液相色譜法，依次采用等度洗脫、一步梯度、多步梯度的洗脫方式，均不能使六種多肽同時全部出峰，且可出峰的多肽保留時間長，色譜峰拖尾嚴重，無法達到同時快速分離檢測的要求，原因可能是六種小分子地龍多肽極性過大，保留過少，不適宜采用高效液相色譜進行分離。之后，嘗試使用毛細管電泳對六種地龍多肽進行分離，在預(yù)實驗中，采用毛細管區(qū)帶電泳模式，六種多肽均可出峰，且分析時間短因此，選擇毛細管電泳區(qū)帶電泳模式對地龍多肽進行分離。

由于多肽均含有羰基基團，具有紫外吸收，因此選擇二極管陣列檢測器（PDA）對多肽進行檢測分析，選擇檢測波長為215 nm。

2.2 緩沖液種類的優(yōu)化

電泳緩沖液種類是樣品組分能否得到完全分離的關(guān)鍵因素之一，緩沖體系不同，物質(zhì)的遷移行為有很大差異。實驗分別考察了硼砂-硼酸，磷酸二氫鈉-硼砂，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，乙酸-乙酸銨及乙酸銨-氫氧化鈉這幾種緩沖液體系對六種地龍多肽遷移行為的影響，結(jié)果見圖1。以乙酸銨-氫氧化鈉溶液為緩沖液時，六種多肽能得到完全分離，且分析時間較短，同時峰面積和峰高較大，因此選擇乙酸銨-氫氧化鈉溶液為最佳緩沖液。

2.3 分離緩沖液pH值的優(yōu)化

圖1 緩沖液種類對分析物遷移時間的影響

緩沖液的pH 決定了各組分的解離程度，即影響其有效淌度，各組分因有效淌度不同而得到分離，因此，緩沖液的pH 是影響各組分分離效果的一大關(guān)鍵。實驗考察了乙酸銨體系（pH值分別為2.0、4.0、6.0的乙酸-乙酸銨緩沖液和pH 值分別為8.0、10.0 乙酸銨-氫氧化鈉緩沖液）在不同pH 值條件下六種地龍多肽的分離效果。結(jié)果表示，當pH 值為2.0 時，各多肽峰拖尾嚴重，且多肽5 及多肽6 在21 min 內(nèi)未出峰。當pH值為4.0 時，各多肽峰無法完全分離，多肽1 和多肽2，多肽3 和多肽4 幾乎完全重合，且拖尾嚴重。當pH 值為6.0時，多肽2和多肽3，多肽4和多肽5無法分離，且出峰時間較長。當pH 值為10.0 時，雖然各多肽出峰時間短，但多肽2 和多肽3 的峰疊加在一塊，無法分離。綜合考慮，選擇緩沖液的最佳pH 值為8.0，結(jié)果見圖2。

2.4 分離緩沖液濃度的優(yōu)化

緩沖液的濃度直接影響了電泳介質(zhì)的離子強度，改變Zeta 電勢，從而影響到電滲流。緩沖液濃度越高，離子強度越強，Zeta電勢越低，電滲流越小，樣品的保留時間越長。同時，緩沖鹽的濃度會影響電泳介質(zhì)的電導(dǎo)，若電導(dǎo)大于樣品溶液的電導(dǎo)會產(chǎn)生堆積效果，提高分析靈敏度。但緩沖液的濃度越高，電流越大，熱效應(yīng)越大，樣品組分峰型展寬嚴重。緩沖液的濃度還會影響溶液的粘度、介電常數(shù)等來影響電滲，離子強度過高或過低都對提高分離效率不利。實驗考察了不同濃度的乙酸銨濃度(固定NaOH 濃度為50 mmol·L-1)對六種地龍多肽分離效果的影響，見圖3。當乙酸銨濃度為50 mmol·L-1時，多肽3 和多肽4，多肽5 和多肽6 無法完全分離，且多肽5 和多肽6 出峰時間較長。乙酸銨濃度為60-90 mmol·L-1，多肽均可在10 min 內(nèi)得到完全分離，且峰面積、峰高和出峰時間差異不大，但隨著乙酸銨的濃度增大，電流明顯增加，焦耳熱明顯增多。因此，選擇最佳的乙酸銨濃度為60 mmol·L-1。

圖2 pH值對5種多肽的分離條件的影響

圖3 不同緩沖液濃度的影響

圖4 六種多肽的電泳譜圖

2.5 分離電壓的優(yōu)化

實驗考察了分離電壓對分離效果的影響。當分離電壓在20-25 kV 之間變化時，遷移時間雖有縮短但不顯著，且隨著電壓增加，電流增大，焦耳熱增多，基線穩(wěn)定性下降，故綜合考慮，選擇分離電壓為20 kV。

綜上所述，優(yōu)化最佳的實驗條件：60 mmol·L-1乙酸銨-50 mmol·L-1氫氧化鈉（pH = 8.0），運行電壓是20 kV，檢測波長是215 nm，壓力進樣3.45 kPa ×10 s，操作溫度為25℃，最優(yōu)條件下的電泳圖見圖4。

2.6 線性關(guān)系、精密度、檢出限及定量限

在最佳實驗條件下，分析測定了一系列不同濃度對照品溶液，以電泳譜圖的峰面積（Y）與相應(yīng)的化合物濃度X（μg·mL-1）進行線性回歸，結(jié)果顯示六種地龍多肽的峰面積和濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限（S/N=3）可低至為1.0μg·mL-1。將濃度為80μg·mL-1的六種地龍多肽混合溶液連續(xù)進樣5 次，結(jié)果顯示各分析物遷移時間的相對標準偏差（RSD）小于1.6%，峰面積的RSD小于9.5%，表明該方法精密度良好。線性關(guān)系、精密度、檢測限及定量限的結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性實驗

配制濃度為80 μg.mL-1的六種地龍多肽混合溶液，分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3 h進樣，記錄Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5 六種多肽的峰面積，并計算其RSD。結(jié)果表明，Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5 六個組分的峰面積的RSD 分別為10%、5.3%、9.0%、9.6%、7.1%、8.8%，說明樣品溶液在3 h內(nèi)能相對穩(wěn)定。

表1 6種多肽的線性方程、定量限、檢出限及精密度

表2 人尿樣中加標回收率的測定結(jié)果

圖5 人空白尿樣(A)及加標尿樣(B)的電泳譜圖

2.8 加標樣品處理

按“1.2.2”項下樣品處理方法對樣品進行處理，然后直接進樣所得圖譜如圖5，所測得的回收率結(jié)果見表2。由表2可知，除了F-1可能由于內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，其他地龍多肽Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、AQ-5的回收率良好。

3 結(jié)論

本文采用毛細管區(qū)帶電泳法同時分離測定了地龍 的 六 種 多 肽，分 別 為Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5。實驗對緩沖液的種類、pH 值、緩沖液濃度、分離電壓進行了優(yōu)化。在最優(yōu)的條件下，六種地龍多肽可以在10 min 內(nèi)實現(xiàn)基線分離。但地龍多肽穩(wěn)定性較差，需要采用地龍鮮品在低溫環(huán)境下方可提取，由于實驗條件限制，未能將該方法用于實際藥材中地龍多肽的測定。但將該方法用于人加標尿樣的測定，回收率良好。本文所建立的方法簡單快速，有望為地龍多肽的分離檢測提供一個新手段。