牛建均，馬四補(bǔ)，劉春艷，張麗艷＊＊，羅 君

（1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽(yáng) 550001）

飛龍掌血又名見(jiàn)血飛，為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血Toddalia asiatica (L.)Lam.的干燥根或根皮，是貴州苗族常用藥物，主要分布于貴州、云南、廣西、四川、陜西等地，具有消腫解毒、化瘀止痛、止血活血、祛風(fēng)除濕之功效，常用于跌撲損傷、吐血、刀傷出血、閉經(jīng)、牙齦出血、口舌生瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及風(fēng)濕痹痛、胃痛、痛經(jīng)等多種痛癥、血癥的治療[1]。目前，國(guó)內(nèi)含有此藥材的制劑主要有關(guān)通舒口服液、復(fù)方復(fù)寧膏、痛可舒酊、清痹通絡(luò)藥酒、復(fù)方伸筋膠囊、龍掌口含液等，用于治療骨傷和腫瘤等方面。現(xiàn)代研究表明，飛龍掌血中含有豐富的香豆素類成分，包括一些簡(jiǎn)單香豆素、吡喃香豆素、呋喃香豆素、雙香豆素等香豆素類成分[2-4]；飛龍掌血根部以及心材中含有大量的生物堿類成分[5-7]；此外，飛龍掌血中含有一類重要天然單體萜類[8]，是天然藥物生物活性成分的重要來(lái)源。同時(shí)，黃酮類化合物是飛龍掌血中一類活性化學(xué)成分[9]。在對(duì)飛龍掌血化學(xué)成分研究的同時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也對(duì)其藥理活性做了大量研究，研究結(jié)果顯示飛龍掌血具有止血凝血[10-11]、抗炎鎮(zhèn)痛[12-13]、抗菌[14]、抗氧化[15]、抗腫瘤[16]等藥理作用。

目前，對(duì)飛龍掌血質(zhì)量控制方法、不同藥用部位間化學(xué)成分差異研究報(bào)道較少，且各地方標(biāo)準(zhǔn)中飛龍掌血的用藥部位均不盡相同。《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003 版）中規(guī)定，飛龍掌血的藥用部位分別是葉和根皮[17]；《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2005 版）（第四冊(cè)彝族藥）規(guī)定飛龍掌血為其干燥莖[18]；《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 版）規(guī)定飛龍掌血為干燥根[19]；《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)規(guī)定飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血干燥根及莖[20]。由此可見(jiàn)，現(xiàn)行各地方標(biāo)準(zhǔn)中，飛龍掌血的用藥部位主要為根皮、根、莖和葉，藥用部位因地區(qū)用藥習(xí)慣有明顯差異，然其化學(xué)成分是否有差異，研究報(bào)道較少，大多為單一部為的化學(xué)成分分析及藥理研究。對(duì)飛龍掌血不同部位的化學(xué)成分差異研究的報(bào)道主要是運(yùn)用HPLC 指紋圖譜對(duì)其進(jìn)行對(duì)比研究。有學(xué)者采用HPLC 梯度洗脫的方法，建立飛龍掌血根部和根皮部的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行比較分析，并明確指認(rèn)出20 個(gè)共有峰，研究結(jié)果顯示飛龍掌血根部與根皮部色譜指紋圖譜的整體面貌相近，但其根部色譜指紋圖譜中色譜峰數(shù)目和峰面積較根皮部均有明顯減少，與共有模式的相似度較低[21]。有研究者利用HPLC 建立了不同部位的飛龍掌血指紋圖譜，指認(rèn)出5個(gè)共有峰，并對(duì)共有峰比較分析，結(jié)果顯示其藥材的根、莖、葉的指紋圖譜完全不一致，不同部位的藥材化學(xué)成分差異明顯[22]。有研究對(duì)全國(guó)不同產(chǎn)地的飛龍掌血藥材的指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的見(jiàn)血飛藥材質(zhì)量差別較大[23]。

表1 樣品來(lái)源

飛龍掌血作為苗族藥在《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的藥用部位分別是其葉和根皮，為擴(kuò)大根皮藥源和進(jìn)一步的證明標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。課題組前期對(duì)飛龍掌血根皮與莖皮進(jìn)行了HPLC 指紋圖譜研究[24]，標(biāo)定了9 個(gè)共有峰，對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)兩者具有相似性，然而相對(duì)峰面積差異較大，表明其相關(guān)物質(zhì)活性成分的量有一定的差異。但未就其他藥用部位進(jìn)行對(duì)比。因此，本研究在新的研究條件下首次建立了飛龍掌血的根皮、葉和非藥用部位莖皮三者的HPLC 指紋圖譜，分析三者相似度、對(duì)比三者化學(xué)組成的差異，為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中飛龍掌血藥用部位劃分的合理性提供理論依據(jù)，為擴(kuò)大飛龍掌血根皮藥源和加強(qiáng)中藥新品種研究，促進(jìn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AUW120D 型十萬(wàn)分子一電子天平（日本島津公司）；KQ5200DE 聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

白屈菜紅堿對(duì)照品（批號(hào)111718-201402，供含量測(cè)定用），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，磷酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。所需藥材由貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司與恒霸藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物栽培與鑒定教研室魏升華教授鑒定為飛龍掌血（Toddalia asiatica(L.)Lam.）的根皮、莖皮和葉，藥材產(chǎn)地見(jiàn)表1。

1.3 評(píng)價(jià)軟價(jià)

中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國(guó)家藥典委員會(huì)，2012年A版）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）系統(tǒng)梯度洗脫，程序：0-20 min，10%乙腈；20-40 min，10%-25%乙腈；40-60 min，25%-50%乙腈；60-80min，50%乙腈。檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：28℃；體積：20μL。

圖1 白屈菜紅堿HPLC色譜圖

2.2 供試品溶液制備

取適量飛龍掌血藥材粉碎（過(guò)3號(hào)篩）稱取約0.2 g，精密稱定，加50 mL 的50%乙醇超聲1.5 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

取白屈菜紅堿對(duì)照品2.22 mg，精密稱定，加50%乙醇定容至100 ml，得22.2μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗(yàn)

取同批次樣品，按2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到指紋圖譜。將白屈菜紅堿色譜峰作為參照峰，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別為0%-0.13%，0%-1.72%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批次樣品，分別稱取6 份，按2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依次進(jìn)樣，得到指紋圖譜。以白屈菜紅堿色譜峰為參照峰，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別為0%-1.34%，0%-1.61%，結(jié)果表明，重現(xiàn)性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同批樣品，按2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別在0 h，3 h，6 h，9 h，12 h，24 h時(shí)進(jìn)樣，得到指紋圖譜。以白屈菜紅堿色譜峰為參照峰，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別為0%-0.20%，0%-1.92%，結(jié)果表明，穩(wěn)定性良好。

3.2 指紋圖譜建立

3.2.1 共有峰的標(biāo)定

將30 批不同藥用部位的飛龍掌血藥材，按2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測(cè)定。按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，將色圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國(guó)家藥典委員會(huì)，2012 年A 版），得到各部位指紋圖譜疊加圖譜，以白屈菜紅堿色譜峰為參照峰，各自標(biāo)定了14、15、15 個(gè)色譜峰為共有色譜峰，詳見(jiàn)圖1、2、3、4；相對(duì)峰面積詳見(jiàn)表2、3、4。

3.2.2 相似度計(jì)算根據(jù)色譜結(jié)果

將不同部位的飛龍掌血藥材分別使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（藥典委員會(huì)2012 版）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示飛龍掌血葉、根皮、莖皮的相似度分別大于0.997，0.966，0.934，表明生成的共有模式圖具有代表性（表2）。

3.2.3 藥材不同部位HPLC指紋圖譜對(duì)照?qǐng)D譜比較

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)飛龍掌血葉、根皮、莖皮的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了對(duì)比研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉與莖皮和根皮指紋圖譜差異明顯，莖皮與根皮之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖5、6、7、8。

4 討論

4.1 色譜條件的確定

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)[21,24]，在2.1 項(xiàng)下的流動(dòng)相條件及梯度洗脫條件下獲得的色譜峰峰型好，基線平穩(wěn)，分離度良好，色譜峰信息豐富；分別比較了254 nm，269 nm，320 nm，330 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在320 nm 處檢測(cè)的峰數(shù)目較多，指紋圖譜整體特征較好，故選擇320 nm 處進(jìn)行檢測(cè)；分別對(duì)不同柱溫（21℃，28℃，35℃）下的色譜圖比較，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫的升高，色譜信息并無(wú)較大變化，選擇柱溫為28℃。確定為2.1項(xiàng)下的色譜條件。

圖2 10批葉HPLC指紋圖譜

圖3 10批根皮HPLC指紋圖譜

表3 飛龍掌血根皮指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

表4 飛龍掌血莖皮指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

4.2 供試品溶液制備方法的確定

圖5 飛龍掌血HPLC對(duì)照指紋圖譜

表5 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖6 葉與根皮對(duì)照指紋圖譜對(duì)比圖

圖7 葉與莖皮對(duì)照指紋圖譜對(duì)比圖

圖8 莖皮與根皮對(duì)照指紋圖譜對(duì)比圖

分別比較甲醇、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為溶劑提取樣品后，所獲得的高效液相色譜指紋圖譜，結(jié)果采用50%的乙醇提取所得樣品的色譜峰的峰數(shù)較多，峰型較好，指紋圖譜整體特征表現(xiàn)的較好。采用超聲提取法操作簡(jiǎn)便、快速。確定為2.2項(xiàng)下的提取條件。

4.3 飛龍掌血相同部位的化學(xué)成分分析

本研究分別對(duì)飛龍掌血根皮、莖皮和葉進(jìn)行指紋圖譜分析研究。研究發(fā)現(xiàn)三者的指紋圖譜相似度較高，不同批次的相同部位的藥材具有高度相似性，其質(zhì)量可控。但不同批次藥材的峰面積有著明顯差異，RSD 最高可達(dá)66.72%，表明藥材的內(nèi)在相關(guān)活性物質(zhì)的含量存在明顯差別。其中葉的差異相對(duì)較低，RSD 在21%-37%之間，其原因可能是不同批次藥材葉中含有老葉和嫩葉的比例不同。根皮和莖皮的含量差異較大，RSD 在27%-67%之間，其原因可能與藥材的樹(shù)齡，采收時(shí)間和地點(diǎn)相關(guān)。通過(guò)上述對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地可能是導(dǎo)致含量差異明顯的重要因素。

4.4 飛龍掌血不同藥用部位HPLC 指紋圖譜對(duì)比分析

4.4.1 莖皮與根皮對(duì)比分析

課題前期[24]對(duì)莖皮與根皮色譜指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)兩者具有一定相似性，但未對(duì)葉進(jìn)行分析，色譜峰較集中。本研究對(duì)前期色譜條件進(jìn)行調(diào)整，首次建立了飛龍掌血葉、莖皮和根皮三者的指紋圖譜，并對(duì)三者進(jìn)行對(duì)比分析。該飛龍掌血指紋圖譜方法不僅共有峰數(shù)量較多，且各色譜峰間分離度較好。其中，根皮、莖皮均有15 個(gè)共有峰，且各共有峰保留時(shí)間基本一致，兩者色譜峰的整體面貌接近。結(jié)果表明，飛龍掌血根皮與莖皮化學(xué)組成相近，與課題組前期研究[24]相符，為飛龍掌血莖皮作為根皮的使用提供一定理論依據(jù)。對(duì)提高飛龍掌血利用率，促進(jìn)野生資源的合理利用具有重要意義。

4.4.2 葉與莖皮和根皮對(duì)比分析

通過(guò)對(duì)葉與莖皮和根皮的對(duì)照指紋圖譜比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)葉、莖皮、根皮分別有14、15、15 個(gè)共有色譜峰。葉與莖皮和根皮色譜圖差異明顯，特別是在以白屈菜紅堿為有效成分的生物堿部位共有色譜峰個(gè)數(shù)減少明顯，由圖6、7可知，其減少的色譜峰包括a、b、c、d、e、f、g、h、i、j 在內(nèi)的共計(jì)10 個(gè)共有色譜峰。表明飛龍掌血中以生物堿為主體的活性成分主要富集在根皮、莖皮部，葉部相對(duì)較少。但葉色譜圖中共有峰較莖皮，根皮也存在新增，主要體現(xiàn)在藥材葉的色譜圖中的2、3、4、6、8、10、11、13、14 號(hào)在內(nèi)的共計(jì)9 個(gè)共有色譜峰。表明飛龍掌血葉中也存在部分根皮、莖皮中沒(méi)有的活性成分，同時(shí)葉的色譜圖中前段色譜峰較根皮、莖皮明顯增多，表明藥材中一些極性較大的化學(xué)成分主要富集在葉部，根皮、莖皮部相對(duì)較少。

有文獻(xiàn)研究[21-24]飛龍掌血的指紋圖譜，但對(duì)葉、根皮、莖皮三者的指紋譜圖相似性對(duì)比研究卻無(wú)報(bào)道。本研究最終發(fā)現(xiàn)飛龍掌血葉與根皮和莖皮的化學(xué)成分差異明顯，而根皮與莖皮的化學(xué)成分相似。貴州省中藥材的地方標(biāo)準(zhǔn)中分別將飛龍掌血葉和根皮作為藥用部位入冊(cè)，其功能主治有不同，是可行且準(zhǔn)確的。本研究也表明飛龍掌血葉和根皮具有顯著差異，為此標(biāo)準(zhǔn)將兩者分開(kāi)入藥提供理論依據(jù)。同時(shí)，本研究結(jié)果進(jìn)一步從理論數(shù)據(jù)上為飛龍掌血莖皮替代根皮的使用提供支撐。從而對(duì)提高飛龍掌血的利用率，促進(jìn)中藥野生資源的合理利用有著非常重要的意義。