華洪葳，李先根，汪 洋，楊驍航，張思怡，楊雨航，劉玉蘭，許 嘯

（動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

氧化應(yīng)激在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在。飼養(yǎng)管理水平低下、飼糧營(yíng)養(yǎng)缺乏、環(huán)境變化以及細(xì)菌和病毒感染等因素均會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低動(dòng)物的免疫力和生產(chǎn)性能，繼而誘發(fā)疾病，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。腸道是重要的消化吸收器官，也是應(yīng)激狀態(tài)下最敏感、最易受損的器官[1]。近年來，鐵死亡作為一種新鑒定的細(xì)胞死亡方式，因有別于傳統(tǒng)的壞死、凋亡及自噬等細(xì)胞死亡方式而成為生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。Dixon等[3]在《Cell》雜志首次提出鐵死亡的概念，指出鐵死亡是一種依賴于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的非凋亡性細(xì)胞死亡方式。鐵死亡的發(fā)生主要靠2條信號(hào)通路共同調(diào)控：正調(diào)控的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（Transferrin Receptor 1，TFR1）/Fe2+信號(hào)通路和負(fù)調(diào)控的胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Cystine/Glutamate Transporter，System Xc-）/GPX4信號(hào)通路。本試驗(yàn)旨在用脂多糖（LPS）建立氧化應(yīng)激模型，通過測(cè)定仔豬空腸上皮細(xì)胞鐵死亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)量以及抗氧化能力，探究LPS刺激后不同時(shí)間空腸上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的變化規(guī)律，以期更精準(zhǔn)地了解仔豬腸道損傷的時(shí)間及機(jī)理，從而為今后緩解仔豬腸道損傷提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 于湖北奧登農(nóng)牧科技有限公司選購(gòu)42頭遺傳基礎(chǔ)和體重（7.17±0.41）kg的21日齡杜×長(zhǎng)×大三元雜交斷奶仔豬，試驗(yàn)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧 根據(jù)斷奶仔豬體重和性別進(jìn)行完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按注射LPS（大腸桿菌血清型055：B5，購(gòu)于Sigma公司）后時(shí)間隨機(jī)分為7個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。飼喂基礎(chǔ)飼糧14 d后，按100 μg/kg BW劑量空腹腹膜皮下注射LPS，分別于0、1、2、4、8、12、24 h屠宰，并取空腸黏膜樣品。取樣具體方法：將10 cm左右腸段用剪刀沿腸系膜縱向剖開，4℃生理鹽水輕輕沖洗腸壁內(nèi)容物，用濾紙吸干水分，然后用載玻片輕輕刮取腸黏膜，分裝在1.5 mL無菌管中，立即放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中凍存?；A(chǔ)日糧參照NRC（2012）進(jìn)行配制（表1）。

1.3 mRNA表達(dá)量的測(cè)定 空腸黏膜細(xì)胞相關(guān)關(guān)鍵基因包括膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）、熱休克蛋白B1（HSPB1）、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）（鐵死亡信號(hào)通路正調(diào)控）；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基（SLC7A11）（鐵死亡信號(hào)通路負(fù)調(diào)控）。以上基因mRNA表達(dá)量采用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）法測(cè)定，根據(jù)已在NCBI上發(fā)表的豬的基因序列，用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，再由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成（表2）。用于合成的cDNA模板，采用20 μL反應(yīng)體系：10.0 μL SYBR? Premix Ex TaqTM（2×），0.4 μL ROX reference dye II（10×），2.0 μL cDNA，6.8 μL RNase free dH2O，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL。使用ABI 7500 Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)：首先 95oC 30 s；隨后進(jìn)行 95oC 5 s，60oC 34 s，40 個(gè)循環(huán)。每份樣本做3個(gè)重復(fù)。本試驗(yàn)將GAPDH作為內(nèi)參基因，各基因的mRNA表達(dá)量采用2-DDCT相對(duì)定量法計(jì)算，各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量用歸一化法處理，以相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量表示。

1.4 空腸上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 總抗氧化力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和丙二醛（MDA）水平采用分光光度計(jì)測(cè)定，具體步驟按照試劑盒說明書。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2010軟件處理實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果，用SPSS 22.0對(duì)LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)mRNA的表達(dá)量以及抗氧化指標(biāo)進(jìn)行Duncan's多重比較。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 LPS刺激后不同時(shí)間的鐵死亡關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的變化 由圖1可知，LPS刺激后不同時(shí)間，空腸上皮細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵基因TFR1、HSPB1、IREB2、SLC7A11和GPX4的mRNA表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。LPS刺激后8 h，TFR1、HSPB1、IREB2、GPX4的mRNA表達(dá)量最大；LPS刺激后2 h，SLC7A11的mRNA表達(dá)量最大。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（飼喂基礎(chǔ)）

2.2 LPS刺激后不同時(shí)間的斷奶仔豬空腸上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的變化 由圖2可知，LPS刺激后不同時(shí)間，空腸上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)T-AOC、GSH和GSH-Px差異顯著（P＜0.05），MDA水平則無顯著性差異（P＞0.05）。其中，在LPS刺激后8、12、24 h，T-AOC及GSH-Px活性均顯著降低（P＜0.05）；LPS刺激后8 h，GSH濃度達(dá)到最低（P＜0.05）。

圖1 LPS刺激后不同時(shí)間斷奶仔豬空腸上皮細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)變化

圖2 LPS刺激后不同時(shí)間斷奶仔豬空腸上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的變化

3 討 論

鐵死亡是一種全新的細(xì)胞死亡模式，它在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面與其他細(xì)胞死亡方式均有明顯不同。在形態(tài)學(xué)方面，發(fā)生鐵死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整且皺縮、線粒體體積縮小、線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂等[3]。在生化方面，發(fā)生鐵死亡細(xì)胞的GSH耗竭，GPX4活性下降，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GPX4催化的谷胱甘肽還原反應(yīng)代謝，繼而二價(jià)鐵離子以芬頓（Fenton）反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[4]。

現(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞鐵死亡有其獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它需要細(xì)胞內(nèi)TFR1/Fe2+與System Xc-/GPX4信號(hào)通路的雙重反饋調(diào)節(jié)，鐵死亡的信號(hào)通路在近些的研究中正逐步被揭開。鐵元素是幾乎所有生物必須的微量元素，它是各種重要酶的活性中心，發(fā)揮著重要的生理作用[5]。TFR1是細(xì)胞膜上的膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，鐵以三價(jià)鐵（Fe3+）形式首先在TFR1作用下被轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并定位到核內(nèi)體上，隨后被前列腺6次跨膜上皮抗原3（STEAP3）的鐵氧還原酶還原成二價(jià)鐵（Fe2+）。本試驗(yàn)表明，TFR1表達(dá)量在LPS刺激后8 h時(shí)最大，說明此時(shí)Fe3+向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率達(dá)到最大，鐵死亡發(fā)生最為劇烈。Imai等[4]研究表明，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)增加鐵攝入或減少鐵的存儲(chǔ)導(dǎo)致鐵池中鐵過載，過載的Fe2+可通過芬頓反應(yīng)氧化脂質(zhì)產(chǎn)生ROS，從而損壞細(xì)胞器導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。本試驗(yàn)中，TFR1表達(dá)量的變化趨勢(shì)間接證實(shí)了氧化應(yīng)激狀態(tài)下有大量Fe3+進(jìn)入胞內(nèi)，與Imai等[4]的研究結(jié)果相一致。Gao等[6]研究表明，HSPB1（Heat Shock Protein B1）在鐵攝取的過程中可通過抑制TFR1的表達(dá)而降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度，因此過表達(dá)的HSPB1會(huì)抑制鐵死亡。本試驗(yàn)中，HSPB1的表達(dá)量也是在LPS刺激后8 h達(dá)到最大，此時(shí)細(xì)胞自身保護(hù)，在最大程度上抑制鐵死亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制鐵代謝的主要轉(zhuǎn)錄因子IREB2可間接抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[7]?？傊驹囼?yàn)中鐵死亡關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)LPS刺激后8 h，斷奶仔豬空腸上皮細(xì)胞的TFR1、HSPB1、IREB2的表達(dá)量均達(dá)到最大，TFR1表達(dá)量不斷上升說明空腸上皮細(xì)胞內(nèi)的Fe3+在不斷積累，并向Fe2+形式轉(zhuǎn)化，發(fā)生芬頓反應(yīng)，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；同時(shí)，機(jī)體抑制鐵死亡的自我保護(hù)因子HSPB1和IREB2的表達(dá)量提高，也說明空腸上皮細(xì)胞隨著鐵死亡的加劇，機(jī)體自我保護(hù)系統(tǒng)啟動(dòng)。

表2 引物序列、目的片段及登錄號(hào)

細(xì)胞內(nèi)存在多種抗氧化通路可清除過量ROS，研究表明與細(xì)胞鐵死亡有密切關(guān)系的為system Xc-/GPX4信號(hào)通路[4]。System Xc-（由SLC7A11和SLC3A2 2個(gè)亞基通過二硫鍵組成，SLC7A11是決定System Xc-表達(dá)量的關(guān)鍵亞基）可將谷氨酸轉(zhuǎn)出細(xì)胞，同時(shí)將胱氨酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞，隨后胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸并合成GSH。GSH可在GSH過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）的作用下還原ROS，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[8]。但當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)抗氧化酶活性下降，特別是特異性抑制鐵死亡的GPX4活性降低，從而導(dǎo)致ROS攻擊線粒體膜和細(xì)胞膜，最終使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[9]。本試驗(yàn)中，LPS刺激斷奶仔豬8、12、24 h后，空腸上皮細(xì)胞的T-AOC顯著下降，且刺激24 h后，T-AOC降到最低，說明LPS刺激降低了斷奶仔豬的抗氧化系統(tǒng)，使機(jī)體發(fā)生了氧化應(yīng)激?？漳c上皮細(xì)胞的GSH含量呈先下降后上升趨勢(shì)，在LPS刺激后8 h達(dá)到最低，說明機(jī)體在LPS刺激后8 h氧化應(yīng)激最為嚴(yán)重，機(jī)體內(nèi)有大量ROS積累，這與鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)量達(dá)到最高相一致。本試驗(yàn)中，SLC7A11在LPS刺激后8 h的表達(dá)量并未升高，這說明細(xì)胞并未在氧化應(yīng)激條件下增加胱氨酸轉(zhuǎn)入；同時(shí)，雖然在LPS刺激后8 h GPX4基因表達(dá)量和GSH含量有所提高，但GSH-Px活性并未提高，這說明腸黏膜細(xì)胞的抗氧化水平降低。Zeng等[10]和Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致仔豬腸黏膜損傷，機(jī)體抗氧化酶活性降低，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。以上結(jié)果說明，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致仔豬腸黏膜細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，除了添加抗氧化劑提高仔豬的抗氧化能力外，還可添加抑制鐵離子富集的阻斷劑來緩解仔豬腸道損傷。進(jìn)一步開展鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控因子的蛋白表達(dá)量和腸黏膜中Fe2+濃度的測(cè)定、細(xì)胞膜和細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化觀察，可更深入地了解鐵死亡的機(jī)制與特點(diǎn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，在LPS刺激斷奶仔豬后，空腸上皮細(xì)胞鐵死亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量改變，抗氧化能力下降，說明LPS刺激可誘導(dǎo)空腸上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并且在刺激后8 h空腸上皮細(xì)胞鐵死亡程度最嚴(yán)重。