李先根，汪 洋，王秀英，朱惠玲，劉玉蘭

（武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體會(huì)合成并釋放腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 -1β（IL-1β）、IL-6 等炎性細(xì)胞因子[1]，這些炎性細(xì)胞因子過(guò)量釋放會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，使組織損傷或功能紊亂，最終導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降、發(fā)病，甚至死亡[2]。

Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路主要包括TLR4、骨髓分化因子88（MyD88）、IL-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）等關(guān)鍵基因。NOD信號(hào)通路主要有NOD1、NOD2和受體互作蛋白2（RIPK2）等關(guān)鍵基因。研究表明，TLR4和NOD被激活后，可以進(jìn)一步激活下游相關(guān)分子，如核因子-κB（NF-κB），從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)和釋放，最終導(dǎo)致機(jī)體組織或器官損傷[2-3]。炎性細(xì)胞因子還可通過(guò)改變叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）/泛素-蛋白酶體途徑（UPP）導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)降解[4]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO的靶基因，即肌肉環(huán)指蛋白1（MuRF1）、肌萎縮F-box蛋白（MAFbx）是調(diào)控蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵基因[5]。研究表明，脂多糖（LPS）可以激活TLR4和NOD信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的合成與釋放[6]。目前，關(guān)于LPS對(duì)腸道、肝臟等組織TLR4和NOD信號(hào)通路影響的研究只集中于單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，尚未有動(dòng)態(tài)規(guī)律研究。因此，本試驗(yàn)旨在探究LPS刺激后不同時(shí)間斷奶仔豬肌肉炎癥和蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的變化規(guī)律，為尋找緩解免疫應(yīng)激的方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 LPS：大腸桿菌血清型055：B5，購(gòu)于Sigma公司，以100 μg/kg體重（BW）劑量注射。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì) 選擇42頭（7.1±0.9）kg杜×長(zhǎng)×大三元雜斷奶仔豬，按注射LPS之前（0 h）和注射LPS后1、2、4、8、12、24 h隨機(jī)分為7個(gè)處理，每個(gè)處理6頭豬。預(yù)試14 d后，腹腔注射100 μg/kg BW的LPS，全部麻醉、屠宰，取背最長(zhǎng)肌樣品待測(cè)。

1.3 mRNA表達(dá)分析

1.3.1 主要儀器與試劑 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）儀（Applied Biosystems）、梯度升降溫功能PCR儀（TaKaRa）、Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo）、Tanon-4100凝膠成像系統(tǒng)（上海天能）；RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）、PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser（cDNA合成試劑盒）和SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（real-time PCR試劑盒）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3.2 測(cè)定方法 組織總RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR參照陳少魁等[8]的方法。Real-time PCR數(shù)據(jù)計(jì)算采用Livak等[9]的2-ΔΔCt法，以肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成 TNF-α、TLR4、MyD88、IRAK1、NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB基因的引物序列參照陳少魁等[8]。IL-1β、IL-6、FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx、β-actin引物序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.10表示具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 LPS對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)量的影響 由表2可知，與對(duì)照組（0 h）相比，注射LPS 1 h后TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值（P＜0.05），2 h后IL-6 mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值（P＜0.01)。

2.2 LPS對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌TLR4和NOD信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響 由表3可知，與對(duì)照組（0 h）相比，注射LPS導(dǎo)致大多數(shù)TLR4和NOD信號(hào)通路基因表達(dá)上調(diào)，其中，在2～4 h，TLR4、MyD88、NOD2、RIPK2 mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值（P＜0.05)。

2.3 LPS對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響 由表4可知，與對(duì)照組（0 h）相比，注射LPS 12 h后FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值（P＜0.05）。

3 討 論

從腹膜注射一定劑量的LPS是構(gòu)建仔豬免疫應(yīng)激模型最經(jīng)典的方式[10]。Zhu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，注射LPS 4 h后，仔豬腸道出現(xiàn)不同程度的損傷，并導(dǎo)致小腸絨毛脫落、屏障功能受損，小腸炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)量顯著升高。Liu等[12]研究表明，注射LPS 4 h后，仔豬肝臟TNF-α mRNA表達(dá)急劇增加，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷。本研究結(jié)果顯示，背最長(zhǎng)肌中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)量在LPS刺激1～2 h后達(dá)到峰值，4 h后表達(dá)量也顯著升高。這表明注射LPS后首先會(huì)刺激肌肉合成并釋放過(guò)量的炎性細(xì)胞因子[6]。

Fukata等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4和NOD信號(hào)通路在先天性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，并可以調(diào)節(jié)獲得性免疫，但是該信號(hào)通路的過(guò)度激活也會(huì)帶來(lái)一系列不利影響。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)，很多疾病的發(fā)生與這2條炎癥信號(hào)通路的過(guò)度激活相關(guān)，如膿毒癥、炎癥性腸病和感染性休克等。涂治驍?shù)萚14]研究發(fā)現(xiàn)，注射LPS 4 h后，仔豬肝臟中NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB等基因mRNA表達(dá)量顯著升高。王海波等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，注射LPS 4 h后，仔豬下丘腦、垂體、腎上腺等組織NOD1、NOD2、RIPK2、TNF-α 等 基 因 mRNA 表達(dá)量顯著升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，背最長(zhǎng)肌中TLR4、MyD88、NOD2、RIPK2的mRNA表達(dá)量在注射LPS 2～4 h后達(dá)到峰值，這表明LPS刺激后機(jī)體首先合成并釋放過(guò)量的炎性細(xì)胞因子，隨后使TLR4和NOD炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。

UPP主要降解胞內(nèi)蛋白，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾手段。在UPP途徑中，MAFbx和MuRF1是調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)降解的重要因子[5]。肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解時(shí)，F(xiàn)OXO去磷酸化加強(qiáng)，促進(jìn)MAFbx和MuRF1的表達(dá)，最終導(dǎo)致肌肉萎縮[4]。Tamrakar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、NOD以及NF-κB過(guò)度激活可以使肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，同時(shí)能阻止肌肉萎縮后肌纖維的再生。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，背最長(zhǎng)肌中肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx的 mRNA 表達(dá)量在注射LPS 12 h后達(dá)到峰值。這表明LPS刺激后肌肉合成并釋放過(guò)量的炎性細(xì)胞因子，使TLR4和NOD炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵基因及肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因mRNA顯著表達(dá)，從而影響機(jī)體的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。

表3 LPS對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌TLR4和NOD信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響

表4 LPS對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

4 結(jié) 論

LPS刺激誘導(dǎo)肌肉炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)，使TLR4和NOD炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵基因及肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因mRNA顯著表達(dá)。