王建萍，李公存，沙玉芬，顧亮，劉笑宏，蘇佳明

(煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 煙臺 265500)

藍莓屬杜鵑花科越橘屬植物，原產(chǎn)于北美和東亞，是世界上少見的真正藍色漿果[1]。藍莓果實中含有較多的花色素苷、黃酮等生理活性成分，具有防止腦神經(jīng)衰老、增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效[2]，是近年許多國家發(fā)展十分迅速的優(yōu)良果樹之一，尤其是歐美國家[3-4]。我國對藍莓的應用可追溯到20世紀50年代，東北地區(qū)的篤斯藍莓被用來釀酒[5]。20世紀80年代，吉林農(nóng)業(yè)大學郝瑞教授最先率隊對長白山地區(qū)的野生篤斯藍莓資源進行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究，并開始野生藍莓的馴化栽培工作[6]。到2017年我國藍莓栽培面積達到5.59萬hm2，總產(chǎn)量15.43萬t[7]，目前我國藍莓栽培面積和產(chǎn)量列居全球第四位[8]。當前制約藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要原因是育種周期長的問題，常規(guī)的育苗方法不能滿足發(fā)展需求，而通過組織培養(yǎng)和脫毒技術可以獲得比常規(guī)育苗更大量、更優(yōu)質(zhì)的種苗，滿足市場上對藍莓種苗的需求。本研究以藍莓品種杜克和布里吉塔葉片為外植體，研究藍莓葉片離體再生技術，旨在探討藍莓工廠化育苗技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

Cao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同藍莓品種葉片再生頻率不同。本試驗以繼代培養(yǎng)的杜克和布里吉塔2個藍莓品種試管苗為試驗材料，由煙臺農(nóng)科院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得

4月取當年生無病蟲害生長健壯的枝條，摘除葉片后放入加水的容器中，于0～4 ℃條件下冷藏2～3 d，接種前，用洗潔精將枝條洗刷干凈，剪成3～4 cm的莖段，流水沖洗30 min，然后在超凈工作臺上將剪好的莖段用乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1次，然后用0.1%的升汞溶液浸泡8～12 min(根據(jù)枝條老嫩程度)，再用無菌水沖洗4～6次，剪去兩端，接種于誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。生長30 d后轉(zhuǎn)移到改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。

1.2.2 葉片不定芽再生

采取繼代培養(yǎng)30～35 d的試管苗中上部大小一致的幼嫩葉片，剪成0.3 cm見方，近軸面向下接種到預先配置好的培養(yǎng)基上，每個配方培養(yǎng)基上接種120片。以TDZ(一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很強的細胞分裂素活性，可以促進植物芽的再生和繁殖)和ZT(一種細胞分裂素，具有促進細胞分裂、誘導芽的分化等作用)為激素，基本培養(yǎng)基為改良WPM培養(yǎng)基，蔗糖30 g·L-1，瓊脂3.5 g·L-1，pH值為5.0～5.2。進行不同時間的暗培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)。光照強度1 500～2 000 lx，光照時間14 h·d-1，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，空氣相對濕度40%～70%。

1.2.3 暗培養(yǎng)

將葉片接種在培養(yǎng)基上，每個配方分成5份，分別置黑暗中培養(yǎng)0、5、10、15、20 d，后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng)

外植體在增殖培養(yǎng)基上生長30 d左右，剪取高2 cm以上的植株接種到不同配方的生根培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為1/2改良WPM。

2 結果與分析

2.1 不同TDZ濃度對兩個品種藍莓葉片再生的影響

由表1可以看出，TDZ濃度越低，2個藍莓品種葉片再生效果均越差。當濃度為0.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生頻率分別僅有14.2%和10.0%；當TDZ濃度為2.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生芽葉片數(shù)均達到最高，再生頻率分別為65.0%和58.3%。

2.2 不同ZT濃度對兩個品種藍莓葉片再生的影響

由表2可以看出，ZT濃度較低時，2個藍莓品種葉片再生效果較差。當ZT濃度為0.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生頻率分別僅為20.0%和15.0%；當ZT濃度為2.0 mg·L-1時，杜克葉片再生效果最好，再生頻率達82.0%，布里吉塔葉片再生效果也較好；當ZT濃度為2.5 mg·L-1時，布里吉塔葉片再生效果最好，再生頻率為65.8%，杜克葉片再生效果也較好，2個品種間差異不大。

2.3 TDZ和ZT搭配使用對藍莓葉片再生的影響

由表3可知，不同配方培養(yǎng)基對杜克藍莓葉片再生效果不同，在5號培養(yǎng)基上葉片再生效果最好，再生頻率達90%；在6號培養(yǎng)基上再生效果較好，再生頻率為66.7%；在2、3、4號培養(yǎng)基上葉片再生效果較差；在1號培養(yǎng)基上再生效果最差，再生頻率僅為16.7%。

表2 不同ZT濃度對兩個藍莓品種葉片再生的影響

布里吉塔在6號培養(yǎng)基上葉片再生效果最好，再生頻率為80%；在5號培養(yǎng)基上再生效果較好，再生頻率為73.3%；在2、3和4號培養(yǎng)基上再生效果較差，在1號培養(yǎng)基上再生效果最差，再生頻率僅為11.7%。

表3 不同培養(yǎng)基配方對藍莓品種葉片再生的影響

2.4 暗培養(yǎng)時間對藍莓品種葉片再生的影響

由表4可知，暗培養(yǎng)20 d，杜克再生芽數(shù)最多，再生頻率為76.7%；暗培養(yǎng)15和10 d，再生芽數(shù)較高，再生頻率分別為74.2%和62.5%；未經(jīng)暗培養(yǎng)處理時，再生芽數(shù)最低，再生頻率僅為33.3%。

表4 暗培養(yǎng)時間對藍莓品種葉片再生的影響

暗培養(yǎng)15 d，布里吉塔再生芽數(shù)最多，再生頻率達83.3%；暗培養(yǎng)20 d，再生芽數(shù)也較多，再生頻率為73.3%；未經(jīng)暗培養(yǎng)處理時，再生芽數(shù)最少，再生頻率僅為31.7%。

由此可知，在對杜克和布里吉塔進行葉片培養(yǎng)時，經(jīng)過一定時間的暗培養(yǎng)可顯著提高葉片的再生頻率和再生芽數(shù)。不經(jīng)過暗培養(yǎng)，葉片雖有再生能力，但再生力較差。

2.5 生根培養(yǎng)

由表5可以看出，杜克在3號培養(yǎng)基上生根率最高，達100%，平均根長最長，為2.3 cm；2號培養(yǎng)基的生根率較高，為91%，平均根長2.1 cm；在1號和5號培養(yǎng)基上生根率較低，分別為37%和53%；在6號培養(yǎng)基上生根率最低，僅有21%，平均根長最短，僅為0.8 cm。

表5 不同培養(yǎng)基兩個藍莓品種不定梢生根情況

布里吉塔在3號培養(yǎng)基上生根率最高，也達到100%，平均根長為2.5 cm；在2號和4號培養(yǎng)基上生根率較高，分別為85%和87%，平均根長分別為2.0和2.1 cm；在1號和6號培養(yǎng)基上生根率均較低，分別僅有21%和17%。

3 小結與討論

本研究表明，TDZ和ZT能較好地誘導杜克和布里吉塔葉片分化。TDZ濃度較低時，2個藍莓品種葉片培養(yǎng)效果較差；隨著濃度的升高，再生芽葉片數(shù)及再生頻率明顯升高，表明較高濃度的TDZ有利于藍莓葉片再生；ZT濃度較低時，2個藍莓品種葉片培養(yǎng)效果較差，隨著濃度的升高，再生效果明顯變好，但當濃度達到3.0 mg·L-1時，再生效果變差，說明低濃度和高濃度的ZT均不利于藍莓葉片再生。TDZ和ZT搭配使用明顯好于單獨使用的效果，說明兩者搭配使用有利于藍莓葉片再生。

本研究發(fā)現(xiàn)，杜克和布里吉塔葉片再生效果差異不大，這可能與2個品種同屬于北高叢藍莓有關；試驗結果表明，暗培養(yǎng)可明顯提高藍莓葉片不定芽再生能力，暗培養(yǎng)15 d時布里吉塔葉片再生能力最強，暗培養(yǎng)20 d時杜克葉片再生能力最強；結果表明，低濃度和高濃度的IBA均不利于藍莓生根，濃度為1.5 mg·L-1時效果最好，生根率達100%。