李 霜 李 誠 陳安均 劉愛平 劉韞滔 閆 格 袁 亮 伍 幣

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

微生物的生長繁殖是食品腐敗的重要原因，因此殺滅或抑制微生物生長是延長貨架期的基本方法[1]。加熱殺菌會使食品的基本性質(如風味、色澤、蛋白質熱變性等)改變[2-3]、熱敏性成分被破壞[4-5]，從而催生了一系列非熱加工技術，如高壓脈沖電場(high-voltage pulsed electric fields，PEF)技術[6]、振蕩磁場(oscillating magnetic fields，OMF)技術[7]、高靜水壓(high hydrostatic pressure，HHP)技術[8]等。

PEF通過介電擊穿、電穿孔等機制對微生物起到殺菌作用[9-12]。PEF的殺菌原理基于以下兩個方面：一方面使微生物的細胞膜產(chǎn)生不可修復的孔洞從而使其死亡[13]；另一方面使微生物的細胞膜產(chǎn)生可修復的孔洞從而使其亞致死[14]。研究表明，PEF處理還能通過改變酶的二級結構從而鈍化酶活性[15-16]，此外，PEF處理后介質升溫小，一般不會超過5℃[17]。因此，PEF能夠在相對較低溫度下殺滅食品中的微生物，從而延長食品貨架期。目前，PEF技術已投入到液態(tài)食品殺菌保鮮的生產(chǎn)應用中，且在肉制品領域的研究也越來越多，Khan等[18]對比了PEF處理生雞胸肉前后鐵、鋅、鉀的情況，發(fā)現(xiàn)PEF處理不會給雞胸肉的品質帶來顯著的負面影響；Haughton等[19]研究表明，雞胸肉中的10個彎曲桿菌分離菌株均對PEF處理敏感，經(jīng)PEF處理后其數(shù)量顯著減少；Ngadi等[20]研究發(fā)現(xiàn)PEF處理使禽肉冷卻水中的大腸桿菌O157∶H7數(shù)量減少了4個數(shù)量級。

四川農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品加工課題組前期開發(fā)了一款調理牛肉，因為受到以微生物為主要因素的影響，其貨架期只有4 d。故本試驗以該調理牛肉微生物致死率為主要指標，結合分析PEF對調理牛肉蒸煮損失率、色度、剪切力及感官品質的影響，探究PEF技術處理調理牛肉的最佳參數(shù)，以期為PEF技術在調理肉制品中的應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2歲左右公黃牛牛霖，購自雅安市農(nóng)貿(mào)市場，從屠宰完成到試驗開始約3.5 h，牛肉置于冰袋儲運至實驗室；平板計數(shù)瓊脂(PCA)培養(yǎng)基購自北京路橋公司；NaCl(分析純)購自四川省雅安市萬科生物科技公司。

1.2 主要儀器與設備

1.2.1 PEF裝置系統(tǒng) PEF裝置系統(tǒng)由四川農(nóng)業(yè)大學設計開發(fā)，主要由安全系統(tǒng)、脈沖發(fā)生器、處理室3部分構成。系統(tǒng)參數(shù)為：電場強度0～45 kV·cm-1、頻率10～30 kHz、占空比2.3%～48.8%，單極脈沖，試驗波型為方波。

1.2.2 主要設備 CS-10精密色差儀，杭州彩譜科技有限公司；Testo 205穿刺pH計，德國Testo公司；T-105中心溫度計，深圳市拓爾為電子科技有限公司；CT3質構儀，美國Brookfield公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 將牛霖置于4℃冰箱中，待其中心pH值下降到5.6時 (約48 h)取出，去除筋膜，并順著牛肉紋理方向切成50 mm×50 mm×3 mm規(guī)格的薄片，按照四川農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品加工課題組前期研究的工藝流程(整形、切片、稱重、混合配料)進行調理，然后置于PEF處理室中進行進一步處理。同時，設置未進行PEF處理的調理牛肉為空白組。

1.3.2 單因素試驗設計

1.3.2.1 PEF脈沖頻率對調理牛肉各品質指標的影響 在電場強度、占空比、處理時間分別為30 kV·cm-1、2.3%、5 min的基礎上，分析不同PEF電場頻率(13.5、15.4、17.6、19.5、21.5、23.5、25.5、27.6、30.5 kHz)下調理牛肉各品質指標的變化。

1.3.2.2 PEF占空比對調理牛肉各品質指標的影響 在電場強度、電場頻率、處理時間分別為40 kV·cm-1、27.6 kHz、5 min的基礎上，分析不同PEF占空比(2.3%、9.3%、17.3%、24.5%、29.8%、34.4%、39.7%、43.7%、48.8%)下調理牛肉各品質指標的變化。

1.3.2.3 PEF處理時間對調理牛肉各品質指標的影響 在電場強度、占空比、電場頻率分別為40 kV·cm-1、2.3%、27.6 kHz的基礎上，分析不同處理時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9 min)下調理牛肉各品質指標的變化。

1.3.2.4 PEF電場強度對調理牛肉各品質指標的影響 在占空比、電場頻率、處理時間分別為2.3%、27.6 kHz、5 min的基礎上，分析不同PEF電場強度(5、10、15、20、25、30、35、40、45 kV·cm-1)下調理牛肉各品質指標的變化。

1.3.3 響應面試驗設計 以調理牛肉微生物的最高致死率為優(yōu)化指標，在單因素試驗結果的基礎上，以脈沖頻率(A)、占空比(B)、處理時間(C)、電場強度(D)為考察因素，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理設計四因素三水平試驗。響應面試驗設計與因素水平表見表1。

表1 響應面試驗設計與因素水平表Table 1 Design and factors of response surface experiment

1.3.4 PEF處理前后調理牛肉的品質對比 以未進行PEF處理的調理牛肉為空白組，采用優(yōu)化后的工藝條件進行PEF處理的調理牛肉為試驗組，對比PEF處理前后調理牛肉的感官評分、蒸煮損失、剪切力、色度。

1.3.5 調理牛肉各品質指標的測定

1.3.5.1 微生物致死率的測定 參照Liu等[21]的方法測定調理牛肉中的菌落總數(shù)。通過對比分析PEF處理前后菌落總數(shù)的變化考察微生物致死率。

(1)

式中，x：微生物致死率；x1：空白組調理牛肉的微生物菌落總數(shù)；x2：試驗組調理牛肉的微生物菌落總數(shù)。

1.3.5.2 剪切力的測定 采用蘭洋[22]的方法并略作修改。將蒸煮后的牛肉切成肌肉長度為50 mm、寬度為10 mm、厚度為3 mm的長條。探頭采用WBS，測中速度1.5 mm·s-1，下壓距離25 mm，反彈高度20 mm。

1.3.5.3 色值的測定 采用手持色差計測定a*值(紅度)、b*值(黃度)。D65光源，10°視角，自動校正。每個樣品測3次，取平均值，并計算色度(H)值，H=b*/a*[23]。

1.3.5.4 蒸煮損失率的測定 吸干樣品表面的水分后稱重，記錄重量后裝于高溫蒸煮袋中。將高溫蒸煮袋置于80℃水浴鍋中蒸煮，用中心溫度計測量肉品中心溫度。待肉品中心溫度升至75℃后取出并冷卻至室溫，吸干樣品表面水分后記錄重量[24]。按照公式計算調理牛肉的蒸煮損失率：

(2)

式中，m：蒸煮損失率；m1為蒸煮前調理牛肉質量；m2為蒸煮后調理牛肉質量。

1.3.5.5 調理牛肉的感官評價 感官評分小組由5名專業(yè)人員組成，對PEF處理前后調理牛肉的色澤、氣味、組織狀態(tài)及保水性4方面進行客觀評價。感官評分標準參考文獻[24]。當感官評價總得分低于50分，即表示消費者不能接受。

表2 調理牛肉感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of prepared beef

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用Origin Pro 8.0軟件作圖；Design Expert 8.0軟件進行響應面分析；SPSS19.0軟件進行獨立樣本T檢驗。每組試驗均設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 PEF脈沖頻率對調理牛肉品質的影響 空白組調理牛肉的測定結果分別為：蒸煮損失率6.85%±0.027%、色度值(H值)0.671±0.007、剪切力2.87±0.05 N·mm-1。由圖1-A可知，PEF脈沖頻率越高，其對調理牛肉微生物的致死效果越好，當脈沖頻率為30.5 kHz時，調理牛肉微生物致死率達到72.30%。由圖1-B、C、D可知，隨著脈沖頻率的增大，調理牛肉的蒸煮損失率、H值、剪切力未出現(xiàn)規(guī)律性變化，但在大部分脈沖頻率范圍內(nèi)，調理牛肉的蒸煮損失率、H值、剪切力出現(xiàn)不同幅度的升高，不利于品質的改善。脈沖頻率為27.6 kHz時，能殺滅68.75%以上的調理牛肉中的微生物，同時調理牛肉的蒸煮損失率、H值、剪切力低于空白組。故選用27.6 kHz的脈沖頻率進行后續(xù)試驗。

圖1 脈沖頻率對調理牛肉品質的影響Fig.1 Effect of impulse frequency on the quality of prepared beef

2.1.2 PEF電場強度對調理牛肉品質的影響 空白組調理牛肉的測定結果分別為：蒸煮損失率34.73%±0.16%、H值0.689±0.004、剪切力3.26±0.06 N·mm-1。由圖2可知，隨著電場強度的增強，調理牛肉的微生物致死率呈上升趨勢，電場強度為45 kV·cm-1時，微生物致死率為80.94%；當電場強度高于30 kV·cm-1時，調理牛肉蒸煮損失率、H值均低于空白組；當電場強度高于20 kV·cm-1時，調理牛肉的剪切力隨著電場強度的增強而降低。綜上，電場強度為45 kV·cm-1時，PEF處理能使調理牛肉維持較高水平的微生物致死率和較低水平的蒸煮損失率、H值及剪切力。故選用45 kV·cm-1的電場強度進行后續(xù)試驗。

2.1.3 PEF占空比對調理牛肉品質的影響 空白組調理牛肉的測定結果分別為：蒸煮損失率24.35%±0.24%、H值0.792±0.008、剪切力2.00±0.03 N·mm-1。占空比是指一個周期內(nèi)不發(fā)射方波的占比，脈沖寬度與占空比的關系為：脈沖寬度=1/頻率(1-占空比)。由圖3可知，在較低水平的占空比(低于24.5%)條件下，占空比越高，調理牛肉的微生物致死率和剪切力越小，蒸煮損失率和H值越高。因此，后續(xù)條件選用2.3%的占空比，以使微生物致死率較高的情況下，滿足較低水平的H值和蒸煮損失率。

2.1.4 PEF處理時間對調理牛肉品質的影響 空白組調理牛肉的測定結果分別為：蒸煮損失率56.19%±0.41%、H值0.529±0.004、剪切力3.00±0.08 N·mm-1。由圖4可知，隨著PEF處理時間的延長，調理牛肉的微生物致死效率越高；但PEF處理時間過長，會使調理牛肉的H值和蒸煮損失率反彈，且隨著處理時間的延長，調理牛肉的剪切力總體呈上升趨勢。綜上，在5～7 min的處理時間條件下，PEF能在殺滅大多數(shù)微生物(≥71.50%)的基礎上，較好程度地改良調理牛肉的色度和蒸煮損失，同時調理牛肉的剪切力也維持在相對低的水平范圍內(nèi)。故選用5、6、7 min的處理時間進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案設計與結果 在單因素試驗結果的基礎上，以最高微生物致死率為目標，共進行29組試驗，具體試驗方案設計與結果見表3。

2.2.2 二次模型回歸分析 對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到各因素對調理牛肉微生物致死率影響的二元多次回歸模型：

Y=151.956 8-13.128 5A-0.986 35B+25.524 05C-0.935 39D+0.001 069AB+0.000 368AC-0.000 77AD+0.000 052BC- 0.000 109BD-0.036 5CD+0.263 730A2+ 0.028 462B2-1.718 798C2+0.027 548D2。

由表4可知，二元多次回歸方程失擬項不顯著(P=0.873 2>0.05)，回歸模型極顯著(P<0.001)，說明該模型與實際試驗擬合度較好；殘差項是由隨機誤差引起的，方程可靠性較高[25]；變異系數(shù)(CV)反映模型的精準性和可靠性，其值越小可靠性越高，本試驗CV值為1.26，表明模型高度可靠；可靠的模型，其信噪比(signal to noise ratio，SNR)一般應大于4，本試驗SNR為32.965，表明有足夠的模型信號[26]。綜上分析，該二元多次方程可以較好地應用于調理牛肉微生物致死率的預測。A、B、C、D、A2、B2、C2對微生物致死率的影響極顯著，其余項不顯著，說明各因素之間的交互作用較小。各因素F值可以反映其對響應指標的影響，F(xiàn)值越大，影響越顯著，因此，各因素對微生物致死率的影響順序為：D>A>C>B，即電場強度>脈沖頻率>處理時間>占空比。

2.2.3 響應面模型診斷 由圖5可知，預測值內(nèi)部殘差呈隨機散點分布，說明殘差方差齊性符合要求；殘差呈正態(tài)分布，說明模型的準確性很高[27]；試驗預測值呈散點且呈近似直線型分布，說明模型預測值與實際值擬合良好，誤差較小。微擾曲線可在響應優(yōu)化曲面的特定區(qū)域比較各自變量的響應值，曲線越陡直，則說明響應值對因素越敏感，相反，曲線越平緩，則說明響應值對因素變化不敏感。A、C、D對響應值為正影響，B值為負影響，同時，根據(jù)陡直程度可知各因素對響應值的重要程度為：D>A>C>B，這與2.2.2中回歸分析的結論一致。

圖2 PEF電場強度對調理牛肉品質的影響Fig.2 Effect of electric field strength to quality of prepared beef

序號No.ABCD微生物致死率YMcrobial lethality/%125.52.364075.65230.52.364083.76325.517.364069.77430.517.364077.88527.69.353563.21627.69.373570.45727.69.354574.09827.69.374580.60925.59.363565.781030.59.363573.891125.59.364575.931230.59.364584.041327.62.354071.371427.617.354065.00

表3(續(xù))

圖3 占空比對調理牛肉品質的影響Fig.3 Effect of duty cycle to quality of prepared beef

來源Source平方和SS自由度df均方Mean squareF值F value P值P value顯著性Significance模型Model843.303 2731460.23 594 80770.45 613< 0.000 1A196.262 840 11196.2 628 401229.5 626< 0.000 1B105.868 110 71105.8 681 107123.8 307< 0.000 1C137.336 351 91137.3363 519160.6 381< 0.000 1D304.331 114 11304.331 114 1355.9 667< 0.000 1AB0.001 639 0110.001 639 010.0019170.965 7AC3.436 15E-0613.436 15E-064.02E-060.998 4AD0.000 373 69810.000 373 6980.000 4370.983 6BC6.133 22E-0716.133 22E-077.17E-070.999 3BD6.670 19E-0516.670 19E-057.8E-050.993 1CD0.133 22510.133 2250.155 8290.699 0A216.504 227 43116.504 227 4319.30 4490.000 6B216.438 733 98116.438 733 9819.22 7880.000 6C219.162 707 24119.162 707 2422.414 030.000 3D23.076 595 48913.076 595 4893.598 5990.078 7

表4(續(xù))

注:*表示顯著差異(P<0.05)；**表示極顯著差異(P<0.01)。

Note:*indicates significant difference at 0.05 level.**indicates extremely significant difference at 0.01 level.

圖4 PEF處理時間對調理牛肉品質的影響Fig.4 Effect of treat time to quality of prepared beef

2.2.4 響應面模型求解、驗證 通過Design-Expert 8.0.6.1 統(tǒng)計軟件求解2.2.1得到的模型方程，得到PEF處理調理牛肉的最佳條件：脈沖頻率30.5 kHz，占空比2.3%，處理時間6.85 min，電場強度45 kV·cm-1。為了檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件對調理牛肉進行高壓脈沖處理，考慮到的實際操作性，將處理時間設置為7 min，此條件下調理牛肉微生物致死率為87.33%，預測值為90.45%，偏差為1.75%。在優(yōu)化條件下，貯藏第6天時，調理牛肉的菌落總數(shù)達到1×106cfu·g-1，而未經(jīng)PEF處理的調理牛肉的菌落總數(shù)在貯藏第4天即達到1×106cfu·g-1。

2.3 PEF處理前后調理牛肉的品質對比分析

由表5可知，采用優(yōu)化后的PEF參數(shù)條件處理調理牛肉，其H值和蒸煮損失率顯著高于空白組(P<0.05)，剪切力顯著低于空白組(P<0.05)。與空白組相比，試驗組調理牛肉的感官評分有所下降，但兩者差異不顯著。綜上，PEF處理能在一定程度上減緩調理牛肉品質劣變速度。

表5 PEF處理調理牛肉前后的品質指標Table 5 Quality index of prepared beef before and after PEF

圖5 響應面模型診斷分析Fig.5 Response surface model diagnostic analysis

3 討論

蒸煮損失率可反映肉品的保水性[24]；H值(b*/a*，黃度/紅度)反映肉色，H值越小，表明肉色越鮮紅[28]；剪切力則可客觀反映肉品的嫩度[29-30]。本研究結果表明，PEF各參數(shù)的變化不僅會影響調理牛肉中微生物的存活，而且會影響調理牛肉的蒸煮損失率、H值、剪切力，進而影響其顏色、保水性和嫩度，這是因為PEF處理會產(chǎn)生一定的熱量，使肌紅蛋白的抗氧化能力減弱，進一步氧化為高鐵肌紅蛋白，從而使牛肉的色度發(fā)生改變[31]。此外，PEF處理不僅會使肌肉組織產(chǎn)生更多的多孔結構導致更多的水分流失[32]，還會破壞肌肉細胞膜使得Ca2+釋放，而使肌肉的保水性發(fā)生變化[33]。O′Dowd等[34]認為，PEF處理能改變牛肉的肌原纖維小片化指數(shù)，從而使牛肉嫩度發(fā)生改變。本試驗中，PEF處理調理牛肉后其品質劣變是輕微的，依靠人的感官無法顯著的識別出，因此，經(jīng)PEF處理后調理牛肉的感官品質無顯著劣變。

一般情況下，肉品中的微生物數(shù)量超過1×106cfu·g-1即可判定為腐敗。在本試驗條件下，PEF能夠使調理牛肉中87.33%微生物致死，大幅度減少了調理牛肉的初始微生物數(shù)量，使調理牛肉的貨架期延長了2 d。此外，一些微生物(如金黃色葡萄球菌[35]、大腸桿菌[36]、空腸彎曲桿菌[37]等)對PEF具有一定的耐受能力，在今后研究中，應對PEF處理后仍存活的耐受微生物進行菌群分析，再根據(jù)其微生物菌群的特點針對性地聯(lián)用一些其他殺菌技術(如超高壓技術、真空包裝技術、涂膜技術等)進行優(yōu)勢互補，以達到更好的殺菌、抑菌效果。

本研究中，響應面試驗模型能較好的預測PEF處理調理牛肉的微生物致死率，但優(yōu)化后的電場頻率、占空比、電場強度均是試驗設備提供的極限值，并不能反映頻率高于30.5 kHz或占空比低于2.3%或電場強度高于45 kV·cm-1時的情況，這可能是各因素間交互性作用較小的原因之一。在后續(xù)的研究中，可研發(fā)工作范圍更寬的PEF系統(tǒng)，進一步探究PEF處理對調理牛肉的影響。

4 結論

本試驗研究了PEF處理對調理牛肉殺菌效果的影響，并對PEF處理條件進行了優(yōu)化。響應面法優(yōu)化后的PEF處理參數(shù)為：脈沖頻率為30.5 kHz、占空比為2.3%、處理時間為7 min、電場強度為45 kV·cm-1。此條件下，PEF對調理牛肉中的微生物致死率達87.33%，使貨架期延長了2 d，且調理牛肉的感官品質并無顯著降低。本研究結果為PEF在調理肉制品的殺菌保藏中的應用提供了參考。