杜瑩琳 徐雅芬 高貴田,2,* 曹 凡 李朝政 張 鑫

(1陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710119；2陜西省獼猴桃工程技術(shù)研究中心， 陜西 西安 710404)

乙烯是果實(shí)成熟軟化過(guò)程中重要的信號(hào)分子，在果實(shí)的成熟軟化過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。獼猴桃(Actinidiachinensisvar. deticiasa)果實(shí)作為呼吸躍變型漿果，不耐貯藏，其對(duì)乙烯極為敏感，少量外源乙烯處理就可以促進(jìn)獼猴桃果實(shí)的軟化[2]。研究表明，控制乙烯的生物合成，可延緩果實(shí)后熟階段的進(jìn)程，從而達(dá)到保鮮的目的[3]。

獼猴桃果實(shí)的后熟軟化過(guò)程分為前期的軟化啟動(dòng)階段和后期的快速軟化階段，乙烯在其中的主要作用是加快快速軟化階段的果實(shí)軟化進(jìn)程，而與軟化啟動(dòng)階段無(wú)明顯關(guān)系[4]。與乙烯相比，脫落酸(abscisic acid，ABA)在獼猴桃果實(shí)后熟軟化過(guò)程中的作用更明顯[5]。ABA是影響果實(shí)成熟軟化進(jìn)程的重要內(nèi)源激素，在模式植物番茄上的研究表明，施加外源ABA誘導(dǎo)，可以使乙烯合成途徑中關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase，ACO)的表達(dá)量提高且表達(dá)時(shí)間提前，通過(guò)ABA抑制劑氟啶草酮抑制ABA的生物合成，使ACS酶和ACO酶的基因表達(dá)量下降，表明ABA在調(diào)控番茄成熟軟化以及乙烯的生物合成中發(fā)揮著非常重要的作用[6]。此外，ABA處理可以加速番木瓜果實(shí)成熟軟化進(jìn)程，具體表現(xiàn)為果實(shí)硬度起速下降和乙烯釋放高峰提前，而ABA抑制劑氟啶草酮處理組可以抑制乙烯產(chǎn)生，減慢成熟軟化進(jìn)程[7]。研究表明，ABA與乙烯的大量合成密切相關(guān)，在躍變型果實(shí)后熟軟化進(jìn)程中，ABA起到了重要的調(diào)控作用[8]。

黃質(zhì)醛脫氫酶(xanthoxin dehydrogenase, XanDH)隸屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族，催化黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)化為脫落醛(abscisyl aldehyde，ABAld)，是ABA合成過(guò)程中非常重要的一步[9]。2009年，Ma等[10]和Park等[11]分別鑒定到擬南芥中一類被命名為PYR/PYL/RCAR的蛋白，可能為ABA受體。通過(guò)酵母雙雜試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABA可以結(jié)合抗副球菌素蛋白(pyrabatin riesistance，PYR)并抑制蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C，PP2C)的合成，且證實(shí)了PYR可正向調(diào)節(jié)ABA信號(hào)傳導(dǎo)。PP2C是一種單體蛋白磷酸酶，植物中PP2C功能具有多樣性[12]。在高等植物中，PP2C廣泛參與ABA調(diào)控的各種信號(hào)途徑，包括ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)[13]、體眠[14]、離子通道調(diào)控[15]、逆境脅迫[16]等。在擬南芥中，PP2C對(duì)ABA信號(hào)途徑起負(fù)調(diào)控的作用[17]。ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ABA responsive element binding protein，ABRE)結(jié)合因子(ABRE binding factors，ABF)轉(zhuǎn)錄子屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper，bZip)轉(zhuǎn)錄因子的A亞族，在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，ABF可被蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，SnRK)磷酸化，進(jìn)而開(kāi)啟ABRE的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)與ABRE元件相互作用轉(zhuǎn)錄激活逆境響應(yīng)基因的表達(dá)，在植物的抗逆生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。目前，外源乙烯利和外源ABA對(duì)獼猴桃后熟期內(nèi)源ABA及果實(shí)后熟軟化影響的研究已有報(bào)道[19-20]，但外源乙烯利、1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)和外源ABA處理對(duì)獼猴桃后熟衰老的分子調(diào)控機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用乙烯利、1-MCP和ABA處理獼猴桃果實(shí)，分析乙烯利、1-MCP和ABA處理對(duì)獼猴桃果實(shí)內(nèi)源ABA合成關(guān)鍵基因XanDH及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因PYR/PYL、ABF和PP2C在非生物脅迫下基因表達(dá)量的影響，以期為進(jìn)一步探究外源乙烯利、1-MCP以及ABA對(duì)獼猴桃后熟衰老的分子調(diào)控作用及機(jī)理的研究提供新的思路，同時(shí)為開(kāi)發(fā)更高效的獼猴桃貯藏保鮮方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃品種為海沃德，成熟后于2016年11月2日采摘自陜西周至縣虎峰村佰瑞獼猴桃基地，采收當(dāng)天運(yùn)回陜西師范大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷、成熟度相對(duì)一致的果實(shí)，20℃貯藏備用。所用試劑包括三氯甲烷(分析純)、異戊醇(分析純)、異丙醇(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純)等，均購(gòu)自北京威特化工有限公司；水飽和酚(分析純)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乙烯利和ABA處理 參照陳金印等[19]的方法，獼猴桃采后第2天，挑選大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷、成熟度相對(duì)一致的果實(shí)，分別用濃度為50 mg·kg-1的乙烯利和50 mg·kg-1的ABA溶液浸泡果實(shí)2 min，每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每組平行20個(gè)獼猴桃(約1.5～1.8 kg)，然后將果實(shí)在實(shí)驗(yàn)室自然通風(fēng)晾干，再用0.04 mm厚的PE袋包裝標(biāo)記，20℃貯藏備用。

1.2.2 1-MCP處理 獼猴桃采后第2天，挑選大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷、成熟度相對(duì)一致的果實(shí)，將獼猴桃預(yù)冷后取出，每處理設(shè)3次重復(fù)，每組平行20個(gè)獼猴桃(約1.5～1.8 kg)分別放入3個(gè)帶蓋塑料桶中，保持桶內(nèi)1-MCP濃度為1 μL·L-1，室溫密封12 h后，通風(fēng)并用0.04 mm厚的PE袋包裝標(biāo)記，20℃貯藏。以未經(jīng)處理的獼猴桃果實(shí)為對(duì)照。

1.2.3 果實(shí)硬度的測(cè)定 參照陳金印[21]的方法，每隔7 d選取6個(gè)大小、成熟度相對(duì)一致的果實(shí)，采用GY-3型水果硬度計(jì)(浙江托普儀器有限公司)在每個(gè)果實(shí)赤道部位三分點(diǎn)處測(cè)量其硬度。

1.2.4 果實(shí)乙烯釋放量測(cè)定 將8個(gè)獼猴桃果實(shí)(約650 g)置于300 mm型干燥器(上海積坤化工科技有限公司)中，用凡士林涂抹容器邊緣，確保密封性良好，靜置2～5 h。采用注射器從容器橡膠管內(nèi)緩慢抽取1.0 mL氣體，待Agilent 6890N氣相色譜儀[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]的基線平穩(wěn)后迅速將氣體注入色譜柱進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定條件為進(jìn)樣口溫度100℃，火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)溫度150℃，氮?dú)饬魉?0 mL·min-1，氫氣流速30 mL·min-1，空氣流速300 mL·min-1。記錄乙烯出峰時(shí)間、峰寬、峰高、峰面積，計(jì)算乙烯釋放量[22]。在乙烯釋放初期與后期每隔7 d測(cè)一次，乙烯釋放高峰前后每隔 2 d測(cè)一次。

1.2.5 果實(shí)內(nèi)源ABA含量測(cè)定 選取經(jīng)乙烯利、ABA、1-MCP處理后第1(DAH1)、第7(DAH7)、第17(DAH17)、第40(DAH40)、第58天(DAH58)5個(gè)時(shí)期的果實(shí)樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。?nèi)源ABA提取工藝參照趙家昱等[23]的方法，在色譜條件上略做改進(jìn)。采用Waters 1525高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)測(cè)定ABA含量，采用Agilent C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱(安捷倫科技有限公司)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸為45∶50∶5，柱溫30℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.6 獼猴桃果實(shí)總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 參照J(rèn)aakola等[24]的方法，配制緩沖液并提取RNA，采用Nanodrop ND-2000型微量核酸蛋白定量測(cè)定儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]測(cè)定其濃度和純度，結(jié)果顯示RNA濃度介于100～200 ng·μL-1之間，A260/A230值大于2.0，A260/A280值約2.0，表明提取質(zhì)量較好，可用于后續(xù)研究。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)ABA生物合成基因XantDH，ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因PYR/PYL、PP2C、ABF，采用PikoReal 96型實(shí)時(shí)定量PCR儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性2 s，60℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)?8SrRNA，所用引物序列詳見(jiàn)表1，均由天根生化科技(北京)有限公司合成。反應(yīng)體系見(jiàn)表2，采用2-△△Ct法[25]計(jì)算相對(duì)基因的表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013和Origin 8.5 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系Table 2 RT-qPCR reaction system

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)果實(shí)硬度的影響

注：不同小寫(xiě)字母表表示在0.05水平差異顯著。下同。Note：Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.The same as following.圖1 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃硬度的影響Fig.1 Effect of different treatment on hardness variation of Hayward kiwifruit

由圖1可知，隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng)，獼猴桃果實(shí)硬度呈不斷下降的趨勢(shì)。CK在DAH14之前硬度下降明顯，由12.11 kg·cm-2降至3.1 kg·cm-2，之后緩慢下降。與CK相比，ABA和乙烯利處理均加快了果實(shí)的軟化速率，且乙烯利處理較ABA更能促進(jìn)獼猴桃果實(shí)的后熟和軟化。與ABA和乙烯利處理組相比，1-MCP處理可顯著抑制獼猴桃果實(shí)軟化速率，在DAH30時(shí)，1-MCP處理果實(shí)硬度為2.9 kg·cm-2，顯著高于其他處理，表明1-MCP處理能有效延緩獼猴桃果實(shí)的后熟軟化。

2.2 不同處理對(duì)獼猴桃乙烯釋放量的影響

由圖2可知，CK在DAH14左右，乙烯釋放開(kāi)始躍升，到DAH17達(dá)到高峰期，此后開(kāi)始下降，到DAH45乙烯釋放接近結(jié)束。乙烯利處理組前期乙烯釋放規(guī)律與CK類似，同樣在DAH17進(jìn)入乙烯釋放高峰，但高峰期乙烯的釋放量更高，同時(shí)在后期的釋放量也高于CK。ABA處理組的乙烯釋放量高于乙烯利處理組；ABA處理組的乙烯釋放在DAH17開(kāi)始大幅躍升，在DAH30左右達(dá)到峰值，期間持續(xù)高峰釋放，DAH30后乙烯釋放量開(kāi)始降低，在DAH45以后釋放接近結(jié)束。1-MCP處理組在DAH22時(shí)乙烯釋放進(jìn)入高峰期，雖然進(jìn)入高峰期的時(shí)間與CK和乙烯利處理組較為接近，但是乙烯釋放量遠(yuǎn)低于其他3個(gè)處理，表明1-MCP對(duì)乙烯的合成具有明顯的抑制作用。

圖2 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃乙烯釋放量的影響Fig.2 Effect of different treatment on ethylene production of Hayward kiwifruit

2.3 不同處理對(duì)獼猴桃內(nèi)源ABA含量的影響

由圖3可知，CK、乙烯利和外源ABA處理組獼猴桃內(nèi)源ABA含量均在DAH7時(shí)達(dá)到峰值，此后緩慢下降并趨于穩(wěn)定，外源ABA處理下獼猴桃內(nèi)源ABA含量下降速率較CK和乙烯利處理更緩慢。1-MCP 處理組獼猴桃內(nèi)源ABA含量在DAH17時(shí)達(dá)到峰值，為35.96 ng·g-1FW，且與CK差異顯著，表明 1-MCP 處理抑制了獼猴桃內(nèi)源ABA的合成。

圖3 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃內(nèi)源 ABA含量的影響Fig.3 Effect of different treatment on endogenous ABA content Hayward kiwifruit

2.4 不同處理對(duì)獼猴桃XanDH表達(dá)量的影響

由圖4可知，CK組XanDH基因表達(dá)量在DAH17之后變化幅度較小，趨于穩(wěn)定。而乙烯利處理組的XanDH基因表達(dá)量在DAH17時(shí)達(dá)到最大值，隨后急速降低。ABA處理組XanDH基因表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在DAH17時(shí)表達(dá)量最高。其原因可能是外源ABA處理會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源ABA合成受到抑制，當(dāng)外源ABA處理效應(yīng)解除，此時(shí)ABA開(kāi)始大量合成。

圖4 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃XanDH 基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of different treatment on expression of XanDH of Hayward kiwifruit

2.5 不同處理對(duì)獼猴桃PP2C表達(dá)量的影響

由圖5可知，CK組PP2C基因在不同采后時(shí)期表達(dá)量差異較大，在DAH17達(dá)到高峰后逐漸降低。乙烯利處理組PP2C基因表達(dá)量在DAH17后均顯著低于CK。ABA處理組PP2C基因表達(dá)量在DAH17達(dá)到峰值后逐漸回落至低水平，且在后熟中后期的表達(dá)量均顯著低于CK，表明乙烯利和ABA處理抑制了PP2C基因的表達(dá)。 從DAH17起1-MCP處理下組PP2C表達(dá)量較高，采后7 d起與CK間均差異顯著。

圖5 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃PP2C 基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of different treatment on the expression of PP2C Hayward kiwifruit

2.6 不同處理對(duì)獼猴桃ABF表達(dá)量的影響

由圖6可知，CK組的ABF表達(dá)量在采后各時(shí)期存在差異，在DAH17達(dá)到峰值后逐漸回落。乙烯利處理下ABF在整個(gè)采后階段基因表達(dá)量均顯著低于CK。ABA處理組的ABF在DAH17前表達(dá)量較高，經(jīng)歷峰值后急速回落，在后期表達(dá)水平較低。1-MCP處理組ABF基因表達(dá)量較高，且各時(shí)期與CK間均差異顯著。

圖6 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃ABF 基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of different treatment on the expression of ABF of hayward kiwifruit

2.7 不同處理對(duì)獼猴桃PYR/PYL表達(dá)量的影響

由圖7可知，CK組PYR/PYL的表達(dá)量在DAH17達(dá)到高峰后迅速降低，DAH40～DAH58，表達(dá)量較小。乙烯利、ABA、1-MCP處理組，PYR/PYL在DAH17時(shí)期均高于CK，之后乙烯利和ABA處理組PYR/PYL的表達(dá)量迅速降低。1-MCP處理組，PYR/PYL表達(dá)量在DAH17達(dá)到高峰后逐漸回落，但表達(dá)量整體仍處于較高水平與CK間差異顯著。乙烯利和ABA處理組，PYR/PYL表現(xiàn)出一致的表達(dá)趨勢(shì)，在DAH17達(dá)到最高峰后急速回落至低水平狀態(tài)。

圖7 不同處理對(duì)海沃德獼猴桃PYR/PYL 基因表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of different treatment on the expression of PYR/RYL of Hayward kiwifruit

3 討論

前人研究表明，ABA可以觸發(fā)乙烯的生物合成，而乙烯可能作為一種“樞紐”在整個(gè)果實(shí)軟化過(guò)程中發(fā)揮中央監(jiān)管的作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理與對(duì)照相比果實(shí)的軟化進(jìn)程加快，且ABA處理在乙烯釋放量和乙烯釋放時(shí)間跨度上顯著高于對(duì)照組及乙烯利、1-MCP 處理組，進(jìn)一步驗(yàn)證了ABA可以誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生的理論。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)外源ABA處理組獼猴桃后熟期內(nèi)源ABA含量降低速度較其他處理更緩慢，且1-MCP處理會(huì)抑制獼猴桃內(nèi)源ABA的合成并推遲ABA合成高峰的到來(lái)。但本研究對(duì)照組獼猴桃乙烯在DAH17達(dá)到高峰，而ABA處理組DAH17乙烯釋放量顯著低于對(duì)照，為對(duì)照的25.16%，直至DAH30乙烯釋放量才達(dá)到高峰，釋放量為對(duì)照組的3.53倍。這與陳金印等[19]和陳昆松等[20]的結(jié)果不完全一致，推測(cè)可能是由獼猴桃產(chǎn)地、采收時(shí)期造成采后生理差異所致，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

前人研究表明，XanDH正向調(diào)控ABA合成，在ABA生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[27]。本研究中，乙烯利處理組XanDH在DAH17基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照，表明外源乙烯利處理會(huì)促進(jìn)XanDH表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源ABA的合成。PP2C對(duì)ABA信號(hào)途徑起負(fù)調(diào)控作用[28]，本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，乙烯利和ABA處理組中PP2C表達(dá)量均有不同程度降低，1-MCP處理組PP2C表達(dá)量上調(diào)，這與理論上PP2C表達(dá)量降低，ABA含量增加一致。ABA處理組ABF表達(dá)量在DAH17時(shí)顯著高于對(duì)照，與理論上ABF正調(diào)控ABA含量相一致[29]。乙烯利處理組ABF顯著低于對(duì)照，表明外源乙烯利處理對(duì)ABF可能有抑制作用。

1-MCP是乙烯受體抑制劑，能通過(guò)優(yōu)先與乙烯受體進(jìn)行不可逆結(jié)合，從而阻斷乙烯與受體的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致乙烯誘導(dǎo)的與成熟相關(guān)的一系列生理生化反應(yīng)被抑制，最終延遲果蔬成熟[30]。本研究中，在ABA合成及信號(hào)通路中，XanDH、PYR/PYL基因表達(dá)量增幅最大的是1-MCP處理。Mou等[26]也發(fā)現(xiàn)ABA+1-MCP處理下在ABA合成、信號(hào)傳導(dǎo)上的一些基因的表達(dá)量高于單一ABA處理，并推測(cè)1-MCP除了阻斷乙烯受體與乙烯的正常結(jié)合的功能外，還對(duì)海沃德獼猴桃內(nèi)源ABA合成、信號(hào)傳導(dǎo)有較大影響。本研究初步探究了ABA調(diào)控果實(shí)后熟機(jī)理，也為深入探究 1-MCP處理影響獼猴桃后熟軟化過(guò)程提供了重要的理論依據(jù)，但1-MCP是通過(guò)反饋抑制乙烯進(jìn)而作用于XanDH、ABF和PYR/PYL，還是直接作用于XanDH、ABF和PYR/PYL，以及1-MCP處理導(dǎo)致XanDH、PP2C、PYR/PYL基因表達(dá)量大幅升高對(duì)果實(shí)采后生理及品質(zhì)的影響均有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究初步探究了ABA調(diào)控果實(shí)后熟機(jī)理，結(jié)果表明外源乙烯利、ABA、1-MCP處理均會(huì)促進(jìn)內(nèi)源ABA相關(guān)合成基因的表達(dá)，且1-MCP處理組在ABA合成、信號(hào)傳導(dǎo)上的一些基因的表達(dá)量均高于ABA處理組。表明1-MCP可能是通過(guò)影響獼猴桃內(nèi)源ABA的代謝進(jìn)而參與調(diào)控了獼猴桃后熟和衰老。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探究外源乙烯利、1-MCP和ABA對(duì)獼猴桃后熟衰老的調(diào)控作用及機(jī)理提供了新思路。