周慧文 肖 亮 曾文丹 嚴(yán)華兵

(1 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧 530007；2 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530007)

木薯(ManihotesculentaGrantz，2n=36)為大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(Manihot)植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于美洲、亞洲、非洲等地區(qū)[1]。木薯塊根食用價(jià)值較高，是熱帶及亞熱帶地區(qū)的主糧之一，此外，木薯可榨取酒精和淀粉，也是重要的工業(yè)原料[2]。木薯也是我國(guó)僅有的幾種重點(diǎn)發(fā)展生物質(zhì)能源作物之一，受到了人們廣泛的關(guān)注[3]。但目前木薯優(yōu)質(zhì)品種缺乏，良種覆蓋率較低，已無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)生產(chǎn)發(fā)展的需要，因此，選育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特色優(yōu)質(zhì)品種至關(guān)重要[2]。

多倍體育種是改善植物性狀和選育經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良新品種的有效方法之一[4]。植物多倍化后在表型、生理生化等方面會(huì)發(fā)生改變，如葉片增厚，花冠、葉色等色澤加深，花冠、果實(shí)等器官呈現(xiàn)“巨大性”[5]，植株生長(zhǎng)旺盛、抗逆性增強(qiáng)等[6]。目前已有利用多倍體育種手段進(jìn)行木薯育種的研究報(bào)道，如Sree Harsha三倍體木薯塊根產(chǎn)量更高，淀粉含量增多，適應(yīng)性增強(qiáng)，并于1996年在印度通過(guò)了品種審定，但三倍體木薯的獲得需經(jīng)大田雜交工作，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7]；黃慧德[8]研究發(fā)現(xiàn)6068四倍體木薯植株的抗病性、長(zhǎng)勢(shì)、淀粉和總糖含量均高于二倍體，但報(bào)道中未詳細(xì)介紹獲得6068木薯四倍體的具體方法。此外，也有利用秋水仙素加倍木薯的研究報(bào)道[9-11]，但均僅對(duì)誘導(dǎo)鑒定技術(shù)進(jìn)行探討，未對(duì)同源四倍體木薯進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定比較。

本研究以秋水仙素作為誘導(dǎo)木薯四倍體的化學(xué)誘變劑，并結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行木薯優(yōu)良品種南植199的四倍體資源創(chuàng)制，并對(duì)四倍體及其二倍體親本進(jìn)行形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生理生化方面的比較，系統(tǒng)地研究多倍化對(duì)木薯的影響，以期為木薯四倍體育種和挖掘木薯優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯品種南植199由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，并以組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的無(wú)菌健康組培苗為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 木薯同源四倍體離體誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上將木薯組培苗剪切成長(zhǎng)度約1.5 cm，帶單個(gè)腋芽的莖段(以下簡(jiǎn)稱單芽莖段)，將單芽莖段浸泡于含有液體MS培養(yǎng)基的不同濃度的秋水仙素溶液中，秋水仙素溶液濃度分別為0(CK)、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75 g·L-1。每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5瓶。將浸泡于秋水仙素溶液中的單芽莖段放置于震蕩儀上避光震蕩培養(yǎng)(90 r·min-1，27℃)。48 h后將單芽莖段取出，用無(wú)菌水沖洗3遍，濾紙吸干水分，接種至MS+0.05 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗糖+6.3 g·L-1瓊脂的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度27±1℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期為光照12 h光照/12 h黑暗。45 d后統(tǒng)計(jì)各個(gè)濃度下的木薯莖段存活率。

存活率=存活莖段數(shù)/接種數(shù)×100%

(1)

1.2.2 株系倍性鑒定 通過(guò)形態(tài)學(xué)初步觀察，篩選具有四倍體形態(tài)學(xué)特性的植株株系，參照張俊娥等[12]的方法進(jìn)行倍性檢測(cè)。以木薯品種南植199二倍體為對(duì)照，取待測(cè)株系幼嫩葉片0.1 g置于培養(yǎng)皿中，加入400 μL細(xì)胞裂解液(Partec HR-A)并用刀片切碎葉片，靜置30 s后將培養(yǎng)皿中的液體用30 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾至樣品管中。向樣品管加入1 600 μL DNA染色液(Partec HR-B)，染色30 s。最后用Ploidy Analyser-Ⅰ流式細(xì)胞儀(Partec, 德國(guó))檢測(cè)具有四倍體形態(tài)學(xué)特性的植株株系倍性。

1.2.3 二倍體與四倍體植株形態(tài)觀察與比較 將鑒定為四倍體的木薯組培苗與二倍體對(duì)照接種至生根培養(yǎng)基(配方為MS+0.02 mg·L-1NAA+35 g·L-1蔗糖+6.3 g·L-1瓊脂)中。待組培苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30 d后，將四倍體和二倍體組培苗煉苗移栽至大棚中，生長(zhǎng)60 d后觀察不同倍性植株形態(tài)差異，然后將植株轉(zhuǎn)移至大田，觀察不同倍性植株大田中生長(zhǎng)150 d后的形態(tài)。

選取二倍體與四倍體木薯植株成熟葉片，將葉片下表皮朝上放置。用鑷子撕取葉片下表皮置于載玻片上，滴1滴0.5%碘-碘化鉀溶液染色30～60 s，然后覆上蓋玻片，采用Olympus BH-2型4×40×物鏡光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)觀察并拍照，測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)一個(gè)視野內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)倍性統(tǒng)計(jì)5株，每株觀察測(cè)量30個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞。

采用常規(guī)石蠟切片方法觀察木薯二倍體及同源四倍體的葉片橫截面，具體操作步驟參照周慧文[13]的方法。切片經(jīng)番紅染色，中性樹膠封片后，采用Olympus BH-2型4×10×物鏡光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，測(cè)量葉片橫截面、柵欄組織和海綿組織厚度。每個(gè)倍性統(tǒng)計(jì)5株，每株觀察測(cè)量3個(gè)橫截面。

葉綠素含量測(cè)定采用95%乙醇直接提取法[14]，每個(gè)倍性測(cè)量來(lái)源于不同植株的5片葉片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯四倍體誘導(dǎo)和鑒定結(jié)果

由表1可知，隨著秋水仙素濃度的升高，木薯單芽莖段的存活率降低。未經(jīng)秋水仙素浸泡的單芽莖段(CK)存活率為100%；當(dāng)秋水仙素濃度為0.25 g·L-1時(shí)，單芽莖段存活率僅為1.11%；濃度升至0.5 g·L-1時(shí)，單芽莖段存活率為0。死亡的單芽莖段腋芽處有褐化現(xiàn)象發(fā)生，說(shuō)明秋水仙素對(duì)木薯植株有強(qiáng)烈的毒害作用。

表1 不同濃度秋水仙素對(duì)木薯品種南植199組培苗腋芽莖段的誘導(dǎo)效應(yīng)Table 1 Effects of different colchicine concentration on the stem with buds of cassava (cv. Nanzhi 199)

注：同列不同小寫字母表示在0.05 水平上差異顯著。下同。

Note：Different lowercase letters in the same line mean significant difference at 0.05 level. The same as following.

由圖1可知，以二倍體木薯材料的DNA含量為參照，四倍體木薯的DNA含量峰值出現(xiàn)在100的位置，而二倍體木薯DNA含量峰值出現(xiàn)在50的位置；說(shuō)明四倍體木薯的DNA含量為二倍體的2倍，即可證明被鑒定植株材料為二倍體。

本試驗(yàn)先篩選出帶有四倍體特征的組培苗株系，然后通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行連續(xù)繼代。繼代4次后，通過(guò)初步形態(tài)觀察，篩選出14個(gè)疑似四倍體的不同株系的組培苗，其中有11個(gè)株系經(jīng)鑒定發(fā)生了倍性突變，其中有10個(gè)株系被鑒定為同源四倍體，有1個(gè)株系為嵌合體，即純合同源四倍體占變異株系的90.90%，突變株系占被檢測(cè)株系的78.57%，占87個(gè)存活株系的12.51%，即整體的突變率為12.51%。本次誘導(dǎo)的變異株系大部分為純合四倍體，只有1個(gè)嵌合體株系，表明利用組織培養(yǎng)技術(shù)連續(xù)對(duì)疑似變異植株進(jìn)行切割腋芽分離，可以將變異植株的倍性進(jìn)行純化，從而分離出較多的純合同源四倍體。

注：A：二倍體；B：四倍體。Note:A:Diploid.B:Tetraploid.圖1 流式細(xì)胞儀鑒定木薯倍性結(jié)果Fig.1 The results of detecting ploidy-level of cassava by FCM

2.2 木薯二倍體與四倍體形態(tài)差異觀察

由圖2可知，四倍體植株葉片增厚，顏色加深，葉片形態(tài)較寬較圓，葉脈明顯，莖稈節(jié)間距變短。此外，四倍體植株生長(zhǎng)緩慢，較二倍體植株更矮。

注：A: 二倍體移栽苗；B: 四倍體移栽苗；C: 二倍體葉片；D: 四倍體葉片。Note: A: Transplants morphology of cassava diploid. B: Transplants morphology of cassava tetraploid.C: Leaf morphology of cassava diploid. D: Leaf morphology of cassava tetraploid.圖2 木薯二倍體與四倍體的移栽苗 形態(tài)與葉片形態(tài)Fig.2 Leaf morphology and transplants morphology of the original diploid and tetraploid cassava

2.3 木薯二倍體與四倍體葉片解剖結(jié)果比較

木薯同源四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)與二倍體的形態(tài)差異較大，四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞較二倍體顯著增大(圖3-A、B)，且四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、保衛(wèi)細(xì)胞寬和葉綠體數(shù)目分別較二倍體顯著增加了38.34%、40.40%和73.89%，四倍體的氣孔密度較二倍體顯著降低38.91%；四倍體葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度分別較二倍體增加了48.38%、62.69%和35.70%。葉片橫截面觀察結(jié)果表明(圖3-C、D)，染色體加倍后植株葉厚也相應(yīng)增加，且四倍體柵欄組織與海綿組織厚度之比高于二倍體(表2)。

注：A: 二倍體保衛(wèi)細(xì)胞；B: 四倍體保衛(wèi)細(xì)胞；C: 二倍體葉片橫截面；D: 四倍體葉片橫截面。比例尺=30 μm。Note: A:The guard cell of diploid. B: The guard cell of tetraploid. C: The transverse sections of the diploid leaves. D: The transverse sections of the tetraploid leaves. Bar=30 μm.圖3 木薯二倍體與四倍體的葉片解剖形態(tài)Fig.3 The leave anatomical morphology of cassava diploid and tetraploid

倍性Ploidy-level保衛(wèi)細(xì)胞Guard cells葉片橫截面Transverse sections of leaves保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)Length of guard cells/μm保衛(wèi)細(xì)胞寬Width of guard cells/30 μm葉綠體數(shù)目/保衛(wèi)細(xì)胞Number of chloroplasts/guard cell氣孔密度Stomata density 柵欄組織厚度Palisade tissue/μm海綿組織厚度Spongy tissue/μm葉厚Leaf thickness/μm柵欄組織厚度/海綿組織厚度The ratio of palisade tissue and spongy tissue2X18.36±0.50b4.85±0.16b4.75±0.04b9.92±1.23a62.74±3.31b49.47±5.56b128.44±5.91b1.23±0.12b4X25.40±0.33a6.81±0.61a8.26±0.12a6.06±0.75b102.07±8.83a67.13±13.89a189.30±29.42a1.53±0.18a

2.4 木薯二倍體與四倍體葉綠素含量比較

由表3可知，木薯四倍體植株葉綠素含量較二倍體顯著增加。木薯四倍體植株的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別較二倍體植株顯著增加了19.73%、16.04%和18.90%。

表3 木薯二倍體與四倍體葉綠素含量比較Table 3 The comparison of the content of chlorophyll between the diploid and tetraploid cassava /(mg·g-1)

3 討論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)秋水仙素濃度為0.05～0.10 g·L-1時(shí)，木薯外植體存活率較高，當(dāng)濃度高于0.10 g·L-1時(shí)，木薯外植體的存活率降低，表明高濃度秋水仙素對(duì)木薯植株有較強(qiáng)的毒害作用，這與Zhou等[9]和張健[10]的結(jié)果一致，因此0.05～0.10 g·L-1可作為離體誘導(dǎo)木薯四倍體的適宜濃度范圍。聶揚(yáng)眉等[11]利用秋水仙素離體誘導(dǎo)南植199四倍體，倍性鑒定結(jié)果表明嵌合體與二倍體較多，但僅獲得了3株同源四倍體植株，推測(cè)其原因可能是未經(jīng)組織切割分離嵌合體即進(jìn)行倍性鑒定。本研究利用組織培養(yǎng)技術(shù)繼代分離4次木薯變異植株，通過(guò)形態(tài)觀察篩選出形態(tài)疑似突變體的組培苗后再進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定，這樣不僅提高了純合四倍體數(shù)量，還減少了檢測(cè)植株樣本數(shù)，極大降低了流式細(xì)胞儀鑒定倍性的成本。

目前最為精準(zhǔn)的倍性鑒定方法為染色體計(jì)數(shù)法，但該方法較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力[15]。應(yīng)用流式細(xì)胞儀雖然可以在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模檢測(cè)樣品倍性[16]，但流式細(xì)胞儀價(jià)格較貴，鑒定成本過(guò)高。大量研究表明，倍性的差異可以導(dǎo)致氣孔尺寸、密度和保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的顯著差異[17-22]。因此，專家學(xué)者通過(guò)保衛(wèi)細(xì)胞性狀鑒定楊樹[23]、何首烏[24]和燕麥[25]倍性，該方法較為簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確率可靠，且允許在植株苗期時(shí)鑒定倍性[15]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，木薯四倍體與二倍體保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)差異較大，葉綠體數(shù)目也有顯著差別，這為今后利用保衛(wèi)細(xì)胞性狀鑒定木薯倍性提供了技術(shù)參考。

前人研究表明，植物多倍化后與親本表型有較大差異，如苦蕎同源四倍體在葉片數(shù)、花冠數(shù)、種子數(shù)等方面均較二倍體增加[26]。同源四倍體胡楊[27]、黃毛草莓[28]葉片較二倍體增大增厚、顏色加深。本研究中，經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的南植199同源四倍體木薯同樣產(chǎn)生了顯著的表型變異，如葉片變圓、葉色深綠、葉片加厚等現(xiàn)象，推測(cè)原因可能是因?yàn)榛蚪M加倍后受基因“劑量效應(yīng)”的影響[29]。

除了表型會(huì)受基因“劑量效應(yīng)”的影響，生理生化指標(biāo)也會(huì)受到不同程度的影響，如同源四倍體亞麻種的鬼臼毒素含量較二倍體有所增加，因?yàn)槿旧w加倍后，與生物合成的路徑的相關(guān)基因和酶表達(dá)上調(diào)[30]；紫雛菊四倍體株系的菊苣酸含量較二倍體高，生物學(xué)產(chǎn)量也有所增加[31]。木薯品種華南8號(hào)的同源四倍體與其二倍體親本相比，參與碳代謝及能量代謝、光合作用等途徑的相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有所上調(diào)[32]。而八倍體黑果枸杞葉片葉綠素含量顯著低于二倍體和四倍體[33]。本研究中同源四倍體木薯的葉綠素含量均高于二倍體，原因可能是“劑量效應(yīng)”在高倍性植株上表現(xiàn)不明顯，而較多的染色體組易發(fā)生功能紊亂、代謝失調(diào)的現(xiàn)象[33]。在今后的研究中應(yīng)充分研究基因“劑量效應(yīng)”對(duì)木薯四倍體的影響，挖掘四倍體木薯優(yōu)良性狀，為木薯多倍體育種提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，秋水仙素離體誘導(dǎo)木薯南植199的適宜濃度為0.05～0.10 g·L-1，經(jīng)誘導(dǎo)共獲得了10個(gè)同源四倍體株系和1個(gè)嵌合體株系。與二倍體木薯相比，四倍體木薯表型發(fā)生較大變化，如葉片增厚，葉型變寬變圓。解剖結(jié)果表明，四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞較二倍體顯著增大，內(nèi)含葉綠體數(shù)目增加，葉片增厚。四倍體的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量較二倍體也有所增加。本研究成功創(chuàng)制了木薯同源四倍體，豐富了木薯種質(zhì)資源，為木薯多倍體育種提供了一定的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。