朱秀玲，魯亞平

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指對(duì)目睹或親身經(jīng)歷的異乎尋常的災(zāi)難性、威脅性事件的心理創(chuàng)傷，導(dǎo)致延遲出現(xiàn)或長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙[1]。PTSD以其發(fā)病率高、病程長(zhǎng)等特點(diǎn)嚴(yán)重影響人們身心健康而備受關(guān)注。PTSD 于嚴(yán)重創(chuàng)傷的應(yīng)激急性期,海馬、下丘腦和杏仁核等處短期內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)可塑性改變,神經(jīng)纖維髓鞘脫失，并且出現(xiàn)代謝的異常[2]，提示這些腦區(qū)可能為CNS應(yīng)激應(yīng)答敏感區(qū)。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)中重要的組成部分,功能和纖維聯(lián)系十分廣泛,在情緒行為及情緒性學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[3-4],在條件性恐懼的獲得、表達(dá)和消退中起著關(guān)鍵作用[5-6]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、多巴胺(dopamine,DA)及其相關(guān)的酶可能與PTSD發(fā)病密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)條件性恐懼記憶形成的不同階段都受到DA系統(tǒng)的調(diào)控[7]；PTSD患者血漿或血清BDNF水平比健康對(duì)照人群低[8-11]。目前，PTSD傳統(tǒng)藥物治療主要是以三環(huán)類(lèi)抗抑郁劑(如帕羅西汀)為主，但有不同方面副作用，且價(jià)格較為昂貴，部分患者治療無(wú)效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)驗(yàn)證針灸有助于治療創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙[12-14]。電針可能改善認(rèn)知功能，上調(diào)BDNF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[15]。但針灸產(chǎn)生療效的機(jī)制尚不清楚，值得我們進(jìn)一步研究。本研究采用連續(xù)單一刺激(single prolonged stress，SPS)方法制備PTSD模型，觀察電針對(duì)杏仁核TH和BDNF變化的影響，為進(jìn)一步探討PTSD的病理機(jī)制及其電針治療PTSD的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器 成年雄性Wistar大鼠(180～200g)26只,購(gòu)于江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(蘇) 2009-0001；中國(guó)南京],鼠房室溫(20±2)°C，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由飲水和攝食。兔抗大鼠TH抗體購(gòu)自santacruz公司；兔抗大鼠BDNF抗體購(gòu)自博士德公司；G6805-2B型電針儀購(gòu)自上海華誼。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都要根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的指導(dǎo)原則對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將26只Wistar大鼠分為正常對(duì)照組(6只)，模型組、電針組(每組各 10 只)。正常對(duì)照組不做任何處理，其余兩組進(jìn)行造模。

1.3 模型制備 采用2005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的關(guān)于PTSD樣大鼠——SPS模型。將大鼠禁錮2 h，強(qiáng)迫性游水20 min(水深40 cm，水溫25℃)，休息15 min后將大鼠用異氟醚麻醉至意識(shí)喪失：發(fā)現(xiàn)大鼠肢體癱軟、意識(shí)喪失后立即取出，放回原籠飼養(yǎng)。采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field)法對(duì)造模后的大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，根據(jù)水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)和修飾行為(理毛次數(shù))篩選出12只，6只用于模型組，6只用于電針組。

1.4 電針處理 造模第2天，電針組取“百會(huì)”“足三里”穴，用15 mm長(zhǎng)的毫針針刺百會(huì)(頂骨正中，向前、后斜1～2 mm)和足三里(脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)5 mm)并接電針儀，采用連續(xù)波，頻率為2 Hz，雙側(cè)足三里交替進(jìn)行，每次30 min，每日1次，連續(xù)21 d。

1.5 組織標(biāo)本制備 大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉后，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插入穿刺針，先用0.9%生理鹽水進(jìn)行心臟灌注。死亡后取腦組織，置于4%的多聚甲醛溶液24 h后，取出腦組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟Ⅰ和石蠟Ⅱ完成石蠟包埋。

1.6 免疫組化、結(jié)果檢測(cè)，灰度值測(cè)定及細(xì)胞計(jì)數(shù) 石蠟切片機(jī)切出約為5 μm的組織切片，貼于用多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上后置于60℃烘箱2 h，隨后按照抗體說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行TH和BDNF的免疫反應(yīng)和顯色步驟，用PBS代替一抗,作為陰性對(duì)照反應(yīng)。參照Paxinos and Watson(1986)圖譜，在光鏡下觀察杏仁核陽(yáng)性細(xì)胞，平均灰度值測(cè)定，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)選用Image J軟件。

2 結(jié)果

2.1 電針減少PTSD大鼠杏仁核內(nèi)TH水平 大鼠杏仁核通常分為3個(gè)主要的核群：皮質(zhì)內(nèi)側(cè)核群(MeA)、基底外側(cè)核群(BLA)、杏仁中央核(CeA)，故又稱(chēng)杏仁復(fù)合體。3組大鼠的MeA、BLA和CeA都有TH陽(yáng)性纖維著色，呈棕色；正常組和電針組中央杏仁核的TH線(xiàn)段數(shù)目(n=159、n=179)多于內(nèi)側(cè)杏仁核(n=47、n=73)。

正常組杏仁核TH陽(yáng)性纖維著色較弱(圖1A、D、G)，模型組杏仁核TH陽(yáng)性纖維著色較深，統(tǒng)計(jì)顯示纖維線(xiàn)段的數(shù)目較對(duì)照組多(表1，P<0.01)，長(zhǎng)度較對(duì)照組長(zhǎng)(圖1B、E、H；表1，P<0.01)。相比模型組，電針組TH陽(yáng)性纖維線(xiàn)段的長(zhǎng)度變短(表1，P<0.01)，數(shù)目減少(圖1C、F、I；表1，P<0.01)。但電針組與對(duì)照組間TH陽(yáng)性纖維線(xiàn)段的數(shù)目和長(zhǎng)度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，P=0.05)。

2.2 電針增加PTSD大鼠杏仁核內(nèi)BDNF水平 3組大鼠的MeA、BLA和CeA都有BDNF陽(yáng)性染色，胞漿與胞膜著色，呈棕色。正常組杏仁核BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，胞體大而圓，細(xì)胞數(shù)目較多，染色較深(圖2A、D、G)。模型組杏仁核BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，胞體較小，細(xì)胞排列稀疏，染色較淺(圖2B、E、H)。電針組杏仁核BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，胞體大而圓，細(xì)胞數(shù)目較多，染色較深(圖2C、F、I)。模型組BDNF的強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)目(n=17)較正常對(duì)照組(n=55)減少(P<0.01)。電針組BDNF的強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)目較模型組增加(n=64)(P<0.01),且電針組BDNF與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 PTSD及電針對(duì)大鼠杏仁核內(nèi)TH免疫反應(yīng)性的影響

*P<0.01，與正常組相比；△P<0.01，與模型組相比。

表2 PTSD及電針對(duì)大鼠杏仁核內(nèi)BDNF免疫反應(yīng)性的影響

組別外側(cè)杏仁核nx±s內(nèi)側(cè)杏仁核nx±s中央杏仁核 nx±s正常組124148.58±8.79228139.00±15.58208150.12±12.35模型組60177.52±8.01#60168.98±9.16#36188.44±10.06#電針組188150.96±9.97?＄208150.77±12.45?＄＄208161.39±10.67?＄＄F222.752123.978185.965P0.0000.0000.000

#P<0.01，與正常組相比；*P<0.01，與模型組相比；＄P<0.05，＄＄P<0.01，與正常組相比。

A～C.BLA。A.正常組；B.模型組；C.電針組。D～F.MeA。D.正常組；E.模型組；F.電針組。G～I(xiàn).CeA。G.正常組；H.模型組；I.電針組。比例尺=16 μm。免疫組織化學(xué)SABC法。

圖1 大鼠杏仁核內(nèi)TH免疫反應(yīng)結(jié)果

A～C.BLA。A.正常組；B.模型組；C.電針組。D～F.MeA。D.正常組；E.模型組；F.電針組。G～I(xiàn).CeA。G.正常組；H.模型組；I.電針組。比例尺=16 μm。免疫組織化學(xué)SABC法。

圖2 大鼠杏仁核內(nèi)BDNF免疫反應(yīng)結(jié)果

3 討論

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙是指對(duì)目睹或親身經(jīng)歷的異乎尋常的災(zāi)難性、威脅性事件的心理創(chuàng)傷，導(dǎo)致延遲出現(xiàn)或長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙[1]。PTSD于嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激急性期,海馬、下丘腦和杏仁核等處短期內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)可塑性改變,提示這些腦區(qū)可能為CNS應(yīng)激應(yīng)答敏感區(qū)。

杏仁核作為邊緣系統(tǒng)中重要的組成部分,功能和纖維聯(lián)系十分廣泛,在情緒行為及情緒性學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[2-3],在條件性恐懼的獲得、表達(dá)和消退中起著關(guān)鍵作用[4-5]。其中感覺(jué)的輸入和處理主要靠BLA與外側(cè)杏仁核(LA)管理,而恐懼行為的表達(dá)主要靠CeA管理[16]。BDNF由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)與其受體 TrkB 的結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17],當(dāng)有抗傷害性刺激時(shí),BDNF可促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的再生和生理功能的恢復(fù)[18]。臨床研究表明，PTSD患者血漿或血清BDNF水平比健康對(duì)照人群低[7-9]。

本研究結(jié)果顯示正常組杏仁核BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，胞體大而圓，細(xì)胞數(shù)目較多，染色較深；模型組BDNF的強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組減少，細(xì)胞稀疏；說(shuō)明SPS刺激損傷杏仁核(MeA、BLA和CeA)神經(jīng)細(xì)胞，這與以前的研究結(jié)果PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，PTSD造成杏仁核體積變小一致。電針治療后，電針組BDNF的染色強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)目較模型組增加，表明電針對(duì)PTSD大鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用,有效促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)，增加神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)，減輕SPS應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。BDNF在不同組中的變化可能是BDNF本身表達(dá)的改變引起，需要原位雜交來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)。酪氨酸羥化酶是兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、DA、腎上腺素合成的限速酶。DA可能是與警覺(jué)性高、偏執(zhí)、對(duì)創(chuàng)傷線(xiàn)索的敏感性和記憶密切相關(guān)的一種神經(jīng)遞質(zhì)。

蘇珊珊等研究表明，DA系統(tǒng)調(diào)控著條件性恐懼記憶形成的不同階段。在PTSD的發(fā)病過(guò)程中DA扮演著重要作用。有研究顯示，PTSD患者血漿和尿液中DA水平與PTSD的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。解剖學(xué)研究表明DA D1和D2 受體在杏仁核均有高度表達(dá)。研究表明杏仁核接受來(lái)自中縫核5-羥色胺，來(lái)自藍(lán)斑的去甲腎上腺素，及來(lái)自中腦腹側(cè)被蓋的多巴胺能傳入纖維。

本研究結(jié)果顯示正常組杏仁核TH纖維線(xiàn)段的數(shù)目及長(zhǎng)度較弱；模型組杏仁核TH纖維線(xiàn)段的數(shù)目及長(zhǎng)度較正常組增高；這表明在模型組，傳入杏仁核的兒茶酚胺類(lèi)遞質(zhì)神經(jīng)纖維增多，杏仁核在應(yīng)激狀態(tài)下極度活躍。表明杏仁核在PTSD中表現(xiàn)為敏感性增高，并且它的激活與PTSD癥狀的嚴(yán)重程度成正比[19-20]。本實(shí)驗(yàn)電針組TH纖維線(xiàn)段的長(zhǎng)度表達(dá)變短，其染色強(qiáng)度較模型組降低，這表明電針可能抑制了活躍的杏仁核，減少了兒茶酚胺類(lèi)遞質(zhì)的纖維傳入。TH在不同組中的變化可能是TH本身表達(dá)的改變引起，需要原位雜交來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)。

因此，電針可能同時(shí)通過(guò)減少兒茶酚胺遞質(zhì)的纖維傳入和有效促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)等綜合效應(yīng)達(dá)到防治PTSD的作用。