岳瀚勛，余 嫻

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究室，重慶 400010)

細(xì)胞在攝取物質(zhì)時具有一定的選擇性，疏水性小分子化合物易于透過細(xì)胞膜，而強(qiáng)極性、親水性和難溶性化合物只有在相關(guān)載體的幫助下才能通過，使得一大部分具有良好應(yīng)用前景的生物活性分子(如蛋白質(zhì)、多肽和寡核苷酸等)因?yàn)橛H水性問題而難以透過細(xì)胞膜，限制了其臨床應(yīng)用。但這些生物活性分子的優(yōu)點(diǎn)又是突出的，它們通常具有較高的特異性、耐受性和功效[1-2]。為了能夠更好地應(yīng)用這些活性分子，尋找一種合適的載體成為當(dāng)務(wù)之急。20多年前，F(xiàn)RANKEL等[3]從人類免疫缺陷病毒1中提取到轉(zhuǎn)錄活化因子(trans-activating transcriptional activator，TAT)蛋白，并發(fā)現(xiàn)其具有穿透細(xì)胞膜的活性，此后一大批具有類似活性的短肽被發(fā)現(xiàn)，這些短肽被形象地稱為細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)，也叫蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。相比于電穿孔、磁轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和病毒載體等，CPP以其穿膜效率高、細(xì)胞毒性低、可以攜帶各種生物活性分子(包括納米顆粒)等優(yōu)點(diǎn)得到了研究者的廣泛關(guān)注。作為潛在的藥物載體，目前關(guān)于CPP的序列組成、理化性質(zhì)、內(nèi)化機(jī)制、內(nèi)體逃逸和靶向性等方面的研究得到了極大發(fā)展[4-5]。目前已發(fā)現(xiàn)的CPP有上千種，根據(jù)其物理化學(xué)特性可以分為3種類型：(1)陽離子型，如TAT、穿膜素Penetratin、聚精氨酸Polyarginine等；(2)兩親型，如模型兩親肽(model amphiphilic peptide，MAP)；(3)疏水型，如成纖維細(xì)胞生長因子12[6]。CPP的穿膜效率雖然普遍較高，但也存在一些突出問題，如在體內(nèi)應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)，通過熒光等技術(shù)標(biāo)志的CPP在體內(nèi)循環(huán)時因抗蛋白酶水解能力較差，有部分降解，甚至絕大部分降解[7]；此外，CPP內(nèi)吞穿膜后因內(nèi)體逃逸率較低造成大部分被束縛在囊泡(內(nèi)體)中而無法到達(dá)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[8]；最關(guān)鍵的是，CPP可以穿過任何哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致未經(jīng)修飾的CPP的靶向性極差，極大地限制了其作為藥物載體的臨床應(yīng)用[9]。以上問題造成了CPP到達(dá)靶組織或靶細(xì)胞的量大大減少，從而導(dǎo)致藥物的作用降低。為了完善CPP作為藥物載體的功能，各種改進(jìn)方法逐漸見諸報道。本文就CPP的抗蛋白酶水解穩(wěn)定性、內(nèi)體逃逸和靶向性策略3個方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為CPP的改進(jìn)提供新的思路。

1 CPP的抗蛋白酶水解穩(wěn)定性

通過與CPP共價連接或非共價結(jié)合介導(dǎo)的藥物輸送目前得到了廣泛的研究關(guān)注。但因CPP抗蛋白酶水解能力較差，造成其在血液循環(huán)中以及通過上皮細(xì)胞酶促屏障或內(nèi)皮細(xì)胞時被快速代謝清除，從而導(dǎo)致CPP攜載的藥物無法被運(yùn)送到目的組織或細(xì)胞。SARKO等[10]分別比較了人血清中和pc-3荷瘤裸鼠體內(nèi)與1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸 嵌合的10種常用CPP，包括penetratin、TAT、乙肝病毒表面蛋白PreS2轉(zhuǎn)位基序、MAP、九聚精氨酸、膜轉(zhuǎn)運(yùn)序列(membrane transduction sequence，MTS)、核定位信號(nuclear localization signal，NLS)等的穩(wěn)定性，血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除了MAP和MTS外，其他CPP半衰期均< 8 h，而裸鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有CPP被快速清除。該研究還發(fā)現(xiàn)，精氨酸-精氨酸鍵(RR鍵)是影響其穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，且可以通過將CPP連接到大分子載體(如納米顆?；蛑|(zhì)體)上使其清除降低；此外還可以通過修飾穿膜肽本身來增加其穩(wěn)定性。有研究者通過在CPP側(cè)鏈修飾α/β折疊肽和內(nèi)酰胺裝訂肽，一定程度上增加了蛋白酶穩(wěn)定性[11-13]；WOLFE等[14]提出，可以通過將CPP骨架雙環(huán)化來增加穩(wěn)定性。然而，鑒于CPP是一種具有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的載體，在某些情況下側(cè)鏈修飾和骨架環(huán)化會影響其運(yùn)載藥物的能力，因此單獨(dú)增加CPP的穩(wěn)定性缺乏實(shí)際意義。迄今，較有應(yīng)用價值的增加CPP穩(wěn)定性的策略是采用D型非天然氨基酸替換穿膜肽序列中的L型氨基酸來增加其穩(wěn)定性，但不足的是非天然氨基酸會帶來較高的毒性[15-16]。馬嚴(yán)[17]構(gòu)建了一類混合不同數(shù)目D型氨基酸和L型氨基酸的寡聚精氨酸R8，并研究了其生物穩(wěn)定性(酶穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D型精氨酸數(shù)目越多寡聚精氨酸R8的抗酶解能力越高，D型氨基酸數(shù)目超過3個以上時這種趨勢不再明顯；而隨著D型氨基酸數(shù)目的增加，寡聚精氨酸R8的生物毒性(細(xì)胞毒性和系統(tǒng)毒性)也隨之增加，穿膜肽肽鏈中的D型精氨酸數(shù)目≤2個時，D型精氨酸帶來的額外毒性并不明顯；當(dāng)穿膜肽肽鏈中的D型精氨酸數(shù)目≥3個時，穿膜肽的系統(tǒng)毒性開始顯著增加。因此，可以選擇不明顯增加毒性的相應(yīng)數(shù)目的D型氨基酸來增加CPP的穩(wěn)定性。

2 CPP的內(nèi)體逃逸

關(guān)于CPP具體的穿膜機(jī)制一直存在爭論，一般認(rèn)為主要有2種穿膜方式：胞吞作用穿膜和非胞吞作用的直接穿膜。目前，大部分的實(shí)驗(yàn)研究支持胞吞作用穿膜，但經(jīng)過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的貨物分子(CPP和生物活性分子)會被束縛在囊泡(內(nèi)體)中而無法發(fā)揮功能，而且長期被束縛在囊泡中，囊泡與溶酶體結(jié)合后的酸性環(huán)境以及其所包含的各種酶會進(jìn)一步使貨物分子失活或者降解[8]。所以CPP進(jìn)入細(xì)胞后的囊泡束縛成為了CPP應(yīng)用中面臨的大問題。對于該問題的解決策略主要是通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ箖?nèi)吞形成的囊泡破裂而釋放出貨物分子，如通過加入額外的促囊泡滲漏試劑或者修飾穿膜肽使其帶有破壞囊泡膜的結(jié)構(gòu)等。目前發(fā)現(xiàn)的促囊泡滲漏試劑有芘丁酸、聚陽離子肽dfTAT等，將寡聚精氨酸穿膜肽與它們共孵育，結(jié)果顯示均能夠在細(xì)胞水平提高穿膜肽的內(nèi)體逃逸率[18-19]；NEUNDORF等[20]將具有破壞內(nèi)體膜活性的人流感病毒HA2的N末端片段與CPP共價結(jié)合，研究其是否能夠改善穿膜肽的內(nèi)體逃逸，結(jié)果顯示，HA2的N末端片段能夠增加CPP的內(nèi)體逃逸并增加其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布，但同時也明顯增加了CPP的毒性。此外，也有研究者利用組氨酸的咪唑基團(tuán)在酸性環(huán)境下質(zhì)子化促進(jìn)胞吞泡溶脹破裂的策略來增加CPP的內(nèi)體逃逸[21]。除了以上策略，有研究者將CPP與脂質(zhì)體融合，利用脂質(zhì)體在酸性條件下與胞吞泡膜融合來促進(jìn)貨物分子的內(nèi)體逃逸[22]。關(guān)于改善內(nèi)體逃逸的嘗試有很多，但因CPP的穿膜機(jī)制尚未定論，所以每種嘗試均有其不足之處，需要在應(yīng)用CPP時具體考慮。

3 CPP的靶向性

CPP自被發(fā)現(xiàn)以來，便以其穿膜效率高、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)得到了藥學(xué)研究者的青睞，被認(rèn)為是一種有希望的潛在藥物載體，但因?yàn)槠淙狈x擇性，阻礙了其在臨床的應(yīng)用。由于CPP對細(xì)胞的選擇性低，單憑CPP無法使藥物定向蓄積，使作用于靶細(xì)胞或靶組織的藥物濃度減少，對正常組織的損傷增大[23-24]，因此，如何增加CPP的靶向性成為亟待解決的問題。近10余年來，關(guān)于靶向載藥CPP的研究主要集中在腫瘤方面，其中絕大部分研究思路是利用不同“刺激-響應(yīng)”策略來控制載藥CPP進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。在腫瘤組織特異性因素的促發(fā)下，無穿膜活性的載藥CPP變?yōu)橛写┠せ钚缘妮d藥CPP，使其得以選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而減低不良反應(yīng)并提高抗腫瘤療效[25-26]。無穿膜活性的載藥CPP主要通過靜電作用獲得：CPP富含極性帶正電荷的堿性氨基酸，故為多聚陽離子，其與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜具有高度親和力[27]；而通過靜電作用中和CPP的正電荷后，CPP的穿膜活性將顯著減弱。因此，靜電作用應(yīng)用于載藥CPP可顯著減少載藥CPP進(jìn)入非腫瘤組織[28-29]；反之，當(dāng)其進(jìn)入腫瘤組織，腫瘤組織特異性因素促發(fā)靜電作用消失后，CPP可恢復(fù)正電荷進(jìn)而恢復(fù)穿膜活性。

3.1基于腫瘤微環(huán)境高表達(dá)酶設(shè)計的靶向載藥CPP系統(tǒng)2004年，JIANG等[30]首次報道了腫瘤靶向基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase 2/9，MMP 2/9)響應(yīng)的載藥CPP系統(tǒng)，又稱為可活化CPP系統(tǒng) (activatable cell-penetrating peptides，ACPP)，該系統(tǒng)由藥物、CPP R9、MMP2/9底物肽段PLGLAG、多聚陰離子肽段(中和肽)構(gòu)成(圖1)。在進(jìn)入腫瘤組織前，因?yàn)殪o電作用，帶負(fù)電荷的中和肽與帶正電荷的CPP形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使CPP失活；而進(jìn)入腫瘤組織后，高表達(dá)的MMP 2/9酶切掉PLGLAG肽段，釋放中和肽，使載藥CPP恢復(fù)穿膜活性。載藥ACPP系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤診斷和治療的研究報道日益增多，如載紫杉醇(paclitaxel，PTX)ACPPs可顯著增加PTX腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)，并能進(jìn)入腫瘤組織的中心區(qū)域，與PTX及載PTX CPP相比，該系統(tǒng)顯著增強(qiáng)PTX的抗腫瘤活性[31-33]。

圖1基于腫瘤微環(huán)境低pH設(shè)計的靶向載藥CPP系統(tǒng)示意圖

3.2基于腫瘤微環(huán)境低pH設(shè)計的靶向載藥CPP系統(tǒng)腫瘤微環(huán)境中的pH值較正常組織偏低，呈弱酸性，該病理特征已被廣泛用于設(shè)計藥物靶向遞送系統(tǒng)。如KALE等[34]利用腫瘤的弱酸性微環(huán)境設(shè)計了聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG) 和TAT 共同修飾的pH敏感型載DNA脂質(zhì)體，通過一條短的PEG鏈(相對分子質(zhì)量1 000)將TAT修飾在脂質(zhì)體表面，同時將長鏈PEG (相對分子質(zhì)量2 000)通過pH敏感的腙鍵連接在脂質(zhì)體表面形成隱蔽CPP的外殼(圖1)，從而使CPP暫時失去跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。在pH 7.4 條件下腙鍵穩(wěn)定，PEG2000包裹著脂質(zhì)體，使得CPP的功能被掩蔽。當(dāng)該脂質(zhì)體通過體循環(huán)到達(dá)腫瘤部位時，由于pH值降低，腙鍵斷裂，長鏈PEG2000脫離脂質(zhì)體，進(jìn)而暴露出CPP并發(fā)揮跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用；實(shí)驗(yàn)證明，pH 敏感脂質(zhì)體所攜載的DNA在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率是非pH敏感脂質(zhì)體的3倍。

2012年，ZARO等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與MMP 2/9響應(yīng)相比，pH響應(yīng)可更有效地使載藥CPP恢復(fù)穿膜活性。pH響應(yīng)的載藥CPP系統(tǒng)由谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、pH敏感的組氨酸-谷氨酸(histidine-glutamate，HE)重復(fù)寡肽、CPP MAP構(gòu)成(GST-HE-MAP)(圖2)。在正常組織pH環(huán)境下，組氨酸為電中性，谷氨酸的負(fù)電荷通過靜電作用中和CPP的正電荷，CPP的穿膜作用減弱；反之，在腫瘤組織的弱酸性環(huán)境下，組氨酸質(zhì)子化后由電中性變?yōu)閹д姾?，從而中和了谷氨酸的?fù)電荷，消除了谷氨酸與CPP的靜電作用，CPP恢復(fù)穿膜活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在pH6.5及以下環(huán)境，pH響應(yīng)的載藥CCP系統(tǒng)GST-(HE)10-MAP能被細(xì)胞有效攝?。环粗?，在pH7.0及以上環(huán)境中，GST進(jìn)入細(xì)胞的效率顯著降低；在人乳腺癌荷瘤小鼠模型中，該系統(tǒng)亦能被腫瘤細(xì)胞高效攝取，而非腫瘤細(xì)胞攝取GST的量顯著減少[36]。YEH等[37]基于pH響應(yīng)載藥CPP系統(tǒng)制備了HBHAc(CPP)-(HE)15-精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI)，研究證實(shí)，在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人前列腺癌細(xì)胞系PC3的體外實(shí)驗(yàn)中，弱酸性環(huán)境下細(xì)胞攝取HBHAc-HE-ADI顯著增加，且其抗腫瘤活性也顯著增強(qiáng)。

此外，TANG等[38]將此設(shè)計用于納米顆粒，將由寡聚精氨酸R6和pH敏感的組氨酸-谷氨酸重復(fù)寡肽組成的靶向序列偶聯(lián)于包封了PTX的PEG- 聚乳酸聚合物膠束的表面，實(shí)現(xiàn)了PTX的特異性和靶向遞送。

圖2基于腫瘤微環(huán)境低pH設(shè)計的靶向載藥CPP系統(tǒng)示意圖

3.3基于外界刺激設(shè)計的靶向載藥CPP系統(tǒng)HANSEN等[39]提出以紫外線(ultraviolet，UV)作為外界刺激因素，構(gòu)建了UV敏感的靶向載藥CPP系統(tǒng)。其將一個烷基鏈通過UV可裂解的連接臂與已修飾了脂質(zhì)體的TAT相接，在UV照射下，烷基鏈與TAT斷裂，TAT恢復(fù)穿膜活性并介導(dǎo)脂質(zhì)體進(jìn)入靶細(xì)胞。也有研究者認(rèn)為，UV穿透性不強(qiáng)，提出了以近紅外線(near infrared，NIR)作為外界刺激因素，其在CPP的賴氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)上有雙光子敏感的硝基苯衍生物，而硝基苯衍生物結(jié)構(gòu)中的羧基可以屏蔽CPP的正電荷，在NIR的輻射下硝基苯衍生物與CPP解離，從而使CPP恢復(fù)穿膜活性[40]。

關(guān)于CPP的靶向性問題，目前主要采用“刺激-響應(yīng)”策略，而且大部分研究結(jié)果令人滿意，但研究總體上還處于起步階段，未來需要去發(fā)現(xiàn)生物毒性更低、敏感性更高的方法來提高CPP的靶向性。

4 總結(jié)與展望

CPP的發(fā)現(xiàn)極大豐富了藥物載體的研究，其以穿膜效率高、細(xì)胞毒性低和可攜帶多種貨物分子等特點(diǎn)得到了藥學(xué)研究者的青睞。隨著對CPP研究與應(yīng)用的深入，研究者對限制CPP應(yīng)用的問題提出了許多改進(jìn)策略，但目前對CPP的研究整體上仍處于初級階段，需要在穿膜機(jī)制等方面進(jìn)行更深入的研究。此外，仍需研發(fā)穿膜效率更高、毒性更低的穿膜肽，探索敏感性更強(qiáng)的靶向策略，以期使由CPP作為載體的藥物遞送系統(tǒng)得到廣泛的臨床應(yīng)用。