周存通,王遠(yuǎn)飛,王海燕,韋 力,樊曉麗,丁國驊,林植華,*

1 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210023 2 麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,麗水 323000

卵的集中孵化和共同筑巢行為對后代具有優(yōu)勢,包括反捕食作用(例如滅絕的恐龍[1]、昆蟲類[2]、蜘形綱[3]、頭足類[4]、魚類[5]、以及兩棲類[6]),促進(jìn)胚胎對卵黃的吸收使后代個體的體型更大[7- 9],改變孵化環(huán)境的濕度[7],從相鄰卵的新陳代謝中獲得熱量[10- 12],使得卵在孵化過程中位置固定不變[13],確保胚胎交流能夠在同窩卵或異窩卵間進(jìn)行[14- 16]。爬行類和鳥類的同窩個體間會進(jìn)行胚胎交流[17- 19],卵震動,心率,氣味,巢內(nèi)CO2濃度水平,這些都被認(rèn)為是胚胎間潛在的溝通渠道[17]。胚胎間交流能夠調(diào)節(jié)發(fā)育速率[8,16- 18]、或者生長速率[20]促進(jìn)胚胎的同步孵化。同步孵化可以降低個體被捕食風(fēng)險,個體通過下沉動作躲避被捕食,從而提高個體存活幾率[20- 22]。

蝌蚪的集群行為可能是為了減少被捕食或提高覓食效率而進(jìn)化的適應(yīng)行為[23- 24]。蝌蚪與同種個體一起生活的經(jīng)歷對個體集群行為的影響依然是不清楚的,而這種觀察結(jié)果在其他物種中也不盡相同[25- 26]。大多數(shù)關(guān)于社交隔離的影響研究只對個體的親緣和非親緣個體的識別能力進(jìn)行測試評估,并沒有評估蝌蚪先前經(jīng)歷過的社交環(huán)境對后續(xù)社交行為的影響[27- 28]。

野外環(huán)境中鎮(zhèn)海林蛙(Ranazhenhaiensis)的卵呈團(tuán)狀分布,同域分布的克氏原鰲蝦(Procambarusclarkia)、食蚊魚(Gambusiaaffinis)、蜻蜓(Trameachinensis)幼蟲和巴西龜(Trachemysscriptaelegans)對蛙卵存在捕食現(xiàn)象[29- 30],卵團(tuán)經(jīng)過捕食者攝食,殘留的卵粒形成單獨(dú)隔離孵化現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)以鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪為實(shí)驗(yàn)動物,檢驗(yàn)(1)單獨(dú)隔離孵化是否會影響蝌蚪的體型大小和發(fā)育歷期,(2)單獨(dú)隔離孵化是否會影響蝌蚪的社交行為和運(yùn)動表現(xiàn)。

1 材料與方法

2017年1月10日,在校園內(nèi)的臨時性水體中分別采得3窩鎮(zhèn)海林蛙卵團(tuán),發(fā)育歷期為10- 11期。將卵帶回兩棲爬行實(shí)驗(yàn)室后,進(jìn)行卵粒分離,解除卵粒間膠質(zhì)層黏連。每窩卵隨機(jī)取出120粒,分為二組,一組作為卵群一起孵化組,另一組作為單獨(dú)隔離孵化組。卵群一起孵化組的60粒卵置于裝有曝氣24 h自來水的塑料筐(30 cm×20 cm×12 cm)中孵化,水位高度6.5 cm。單獨(dú)隔離孵化組的60粒卵單獨(dú)置于60個圓底透明塑料杯(直徑3.7 cm,高7 cm)中飼養(yǎng),水位高度6.5 cm。溫度設(shè)置25℃,光照周期為12L∶12D,每天進(jìn)行位置變換以減少溫差帶來的影響。

孵化過程的第5天,蝌蚪未孵出記錄各組胚胎在1 min內(nèi)擺尾搏動次數(shù),每組重復(fù)5次。

第9天,蝌蚪全部孵出但未進(jìn)食,對孵出的蝌蚪進(jìn)行形態(tài)特征測定。用Sony DSC-T100數(shù)碼相機(jī)拍攝后用Image J 1.44p軟件讀取蝌蚪的形態(tài)學(xué)特征,包括體長(snout-vent length)和體寬(body width)；用Sartorius天平(±0.001 g)稱體重；用Nikon XTS30體視顯微鏡鑒定發(fā)育歷期[31]；記錄實(shí)驗(yàn)過程中每組蝌蚪的死亡數(shù)。蝌蚪經(jīng)過形態(tài)學(xué)測量后投喂足量的牛蛙飼料(0號,寧波天邦股份有限公司)。

第11天,孵出2天后,蝌蚪已進(jìn)食,同時對環(huán)境有一定的適應(yīng)時間,采用靜水停飼實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行水層分布觀測計數(shù)。水面以下1 cm范圍內(nèi)的蝌蚪為上層,水底以上1 cm范圍內(nèi)的蝌蚪為下層,其余蝌蚪為中層[32],每組重復(fù)觀測計數(shù)3次。

第12天時進(jìn)行孵化條件對蝌蚪社交行為和運(yùn)動表現(xiàn)影響的觀測實(shí)驗(yàn)。在白色陶瓷盤(47 cm×39 cm×2.5 cm)上方架設(shè)一臺Sony DSC-T100數(shù)碼相機(jī)記錄蝌蚪的行為。從3窩卵群一起孵化組分別隨機(jī)選取4只蝌蚪組成12只一組的卵群一起孵化組,重復(fù)4次；從單獨(dú)孵化組的3窩蝌蚪內(nèi)分別隨機(jī)選取4只蝌蚪組成12只一組的單獨(dú)隔離孵化組,重復(fù)4次。蝌蚪放入后開始錄像25 min。在數(shù)據(jù)采集分析時去除前5 min的錄像,然后每隔1 min截取1張圖像,用Image J 1.44p軟件讀取指標(biāo),包括：蝌蚪分布范圍(分布面積率,蝌蚪分布面積/容器面積),個體間距離,最近鄰距離。從第5 min開始,每隔5 min,統(tǒng)計1 min內(nèi)蝌蚪接觸次數(shù),將兩只蝌蚪距離小于0.5 cm時定義為一次接觸[33],運(yùn)動時長和運(yùn)動頻次。

以上數(shù)據(jù)采集時間均為14:00—15:00。數(shù)據(jù)用STATISTICA統(tǒng)計軟件包(verison 6.0)分析。在作進(jìn)一步統(tǒng)計分析前,用Kolmogorov-Simirnov和Bartlet方法分別檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性。用方差分析(ANOVA)、協(xié)方差分析(ANCOVA)及后續(xù)的Tukey′s多重比較分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。非參數(shù)統(tǒng)計用χ2-檢驗(yàn)。描述性統(tǒng)計值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

單獨(dú)隔離孵化組共孵出172尾,卵群一起孵化組共孵出177尾,孵化成功率組間差異不顯著(χ2=2.34,df=1,P=0.126)。

方差分析表明,孵出2天后,單獨(dú)隔離孵化組個體體長(F1, 347=877.70,P<0.001)和歷期(F1, 347=10.04,P<0.002)顯著大于卵群一起孵化組的個體。以體長協(xié)方差分析表明,特定體長的單獨(dú)隔離孵化組個體的體寬(F1, 346=49.51,P<0.001)和體重(F1, 346=8.99,P<0.003)均顯著大于卵群一起孵化組的個體(圖1)。

圖1 卵群一起孵化和單獨(dú)隔離孵化下鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪發(fā)育歷期和形態(tài)特征的描述性統(tǒng)計值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.1 Descriptive statistics of Gosner developmental stage and morphological traits of R. zhenhaiensis larvae incubated under single-embryo and group-embryo treatment: body length, body width, body mass and gosner development stage (mean±SE)

方差分析表明,單獨(dú)隔離孵化組胚胎擺尾搏動頻次顯著小于卵群一起孵化組的個體(圖2,F1, 28=141.57,P<0.001)。在水體的上層(F1, 16=148.97,P<0.001)、中層(F1, 16=359.84,P<0.001)單獨(dú)隔離孵化組個體出現(xiàn)次數(shù)顯著小于卵群一起孵化組的個體次數(shù),在水體的底層單獨(dú)隔離孵化組個體出現(xiàn)次數(shù)顯著大于卵群一起孵化組的個體次數(shù)(圖2,F1, 16=272.28,P<0.001)。

圖2 卵群一起孵化和單獨(dú)隔離孵化對鎮(zhèn)海林蛙胚胎擺尾頻次和蝌蚪活動水層分布比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.2 Comparisons of the tail-beat frequency of embryos and the occurrence frequency of R. zhenhaiensis tadpoles between single-embryo and group-embryo treatment (mean±SE)

方差分析表明,單獨(dú)隔離孵化組個體的分布面積率(F1, 166=107.08,P<0.001)、最近鄰距離(F1, 2014=41.81,P<0.001)、個體間距離(F1, 15831=114.13,P<0.001)均顯著大于卵群一起孵化組的個體,單獨(dú)隔離孵化組個體的接觸頻次(F1, 158=75.17,P<0.001)、運(yùn)動時長(F1, 1336=119.46,P<0.001)、運(yùn)動頻次(F1, 38=19.79,P<0.001)均顯著小于卵群一起孵化組的個體(圖3)。

圖3 卵群一起孵化和單獨(dú)隔離孵化對蝌蚪的活動行為和運(yùn)動表現(xiàn)的影響: 分布面積率、最近鄰距離、個體間距離、接觸頻次、運(yùn)動時長和運(yùn)動頻次(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.3 Effects of hatchling condition on the activity behavior and locomotor performance of R. zhenhaiensis tadpoles: the proportions of area occupied by tadpoles, nearest neighbor distance, distance among individuals, contact frequency, activity duration and activity frequency (mean±SE)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單獨(dú)隔離孵化處理會使鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪體型變大(圖1),這與歐洲林蛙Ranatemporaria蝌蚪結(jié)果一致[26],而與爬行類中的三線石龍子(Bassianaduperreyi)[7],東澳長頸龜(Chelodinalongicollis)[8]和蝰水蛇(Natrixmaura)[9]結(jié)果相反,導(dǎo)致這樣的原因可能跟物種對卵黃的吸收[9],個體的運(yùn)動水平[6],種群密度及其種內(nèi)競爭有關(guān)[34]。例如,更快發(fā)育和過早孵化將改變蝰水蛇胚胎對卵黃的吸收,使得幼蛇體內(nèi)具有更高的脂肪含量[16]。無尾兩棲類個體肌肉組織占比較大,運(yùn)動過程耗能較高[6],卵群一起孵化組個體胚胎擺尾搏動更為頻繁導(dǎo)致個體在未進(jìn)食情況下更多消耗脂肪[5- 36],使得個體體型相較于單獨(dú)隔離孵化組個體較小。做出運(yùn)動決策的可能原因是個體對能量消耗-獲利的權(quán)衡,卵群一起孵化組個體發(fā)育時間較長,對卵黃的吸收更為完全,儲存的能量可以用于活動代謝,而加速孵化導(dǎo)致個體儲能不足,使個體更傾向于采取保守的保存能量策略[37]。此外,單獨(dú)隔離孵化處理組的發(fā)育歷期要比卵群一起孵化組大(圖1),而且發(fā)育歷期的變異系數(shù)也比卵群一起孵化組大(C.Vsingle=0.0270, C.Vgroup=0.0259),說明單獨(dú)隔離孵化使得鎮(zhèn)海林蛙胚胎發(fā)育加速,卵群一起孵化促進(jìn)胚胎發(fā)育同步,這與Nicieza[26]和Aubret[9]的研究結(jié)果一致。當(dāng)卵周圍沒有卵或卵較少時(單獨(dú)隔離孵化),表明當(dāng)前環(huán)境具有較高的被捕食風(fēng)險或者說資源較少,這會促進(jìn)個體加速發(fā)育,快速離開當(dāng)前環(huán)境[9]。而較大窩卵數(shù)(卵群一起孵化)表明當(dāng)前環(huán)境相對安全或者說資源充裕,個體沒有必要加速發(fā)育從當(dāng)前環(huán)境逃離,而且逃離這里也是有風(fēng)險的[38],所以蝌蚪選擇同步發(fā)育共同分擔(dān)風(fēng)險。以往的研究也表明了發(fā)育同步可以提高后代個體的存活幾率[20- 22]。這種情況也存在于其他動物,例如,海龜產(chǎn)卵的淺層地下巢穴存在自上而下的溫度梯度(相差6℃[39]),底部卵(孵化溫度較低)會通過加速發(fā)育或過早孵化促進(jìn)個體同步孵化,雖然過早孵化會降低孵化個體的運(yùn)動表現(xiàn)[16- 18],但從長遠(yuǎn)角度看集群同步孵化帶來的好處可以彌補(bǔ)這一缺陷[21]。

在本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)隔離孵化處理使得蝌蚪集群行為減弱,個體間的接觸頻次顯著降低,蝌蚪的分布面積比率、最近鄰距離和個體間距離顯著大于卵群一起孵化組(圖3)。動物常會通過空間集群行為作為反捕食策略[40-41],例如通過個體間的協(xié)調(diào)運(yùn)動威懾捕食者,或提高個體的警覺效率,或減弱由于稀釋效應(yīng)而導(dǎo)致的個體被捕食者檢測到的可能性,從而降低捕食風(fēng)險[42]；蝌蚪的集群行為可能是試驗(yàn)動物對特定食物的偏好而不是對同種個體信息的偏好造成的(鋤足蟾Scaphiopusmultiplicatus[43])；在自然環(huán)境中觀察到的蝌蚪的聚集行為也有可能是由于產(chǎn)卵數(shù)量大或環(huán)境刺激(如溫度,底物的偏好或食物團(tuán)塊)的結(jié)果而不是社交行為調(diào)節(jié)的結(jié)果(歐洲林蛙R.temporaria[44])。本行為觀察實(shí)驗(yàn)過程中并未給予蝌蚪食物,并在恒定溫度條件完成,所以有理由認(rèn)為先前的孵化條件會影響個體后續(xù)的集群行為模式。

卵群一起孵化時個體間可以通過卵震動、心率變化和化學(xué)信號彼此進(jìn)行交流,在胚胎間建立“社交樞紐,Social bonds”[9,14- 17]。單獨(dú)隔離孵化處理阻斷了胚胎間的“社交樞紐”,不僅改變了個體的集群行為模式,還改變了個體的運(yùn)動表現(xiàn)(圖3)。單獨(dú)隔離孵化組個體對周圍環(huán)境的警覺性較高,更傾向于待在水底,活動水平較低(圖2)。這與黃條背蟾蜍(Bufocalamita)蝌蚪在有捕食者存在的情況下會減弱活動水平并且改變空間分布的結(jié)果一致[45]。而卵群一起孵化組個體對外界環(huán)境探索的范圍更加寬泛,活動水平也高于單獨(dú)隔離孵化組。這種行為在卡斯卡迪蛙(Ranacascadae)[46]和歐洲林蛙(R.temporaria)[26]蝌蚪中也有發(fā)現(xiàn)。在絕大多數(shù)的無尾兩棲類中,當(dāng)個體感知到當(dāng)前環(huán)境具有較高的捕食風(fēng)險時通常會選擇減少運(yùn)動[26,47-48]。這種行為策略可以降低捕食者的檢測速率,因?yàn)轵蝌降奶鞌惩ǔＪ且曈X導(dǎo)向(如蜻蜓Diastatopsobscura幼蟲)或通過水體振動(如狼蛛Schizocosaocreata)來感知獵物,尤其是生活在臨時性水體內(nèi)的個體[49]。

總之,單獨(dú)隔離孵化使得孵化個體發(fā)育較快,體型較大,社會性和活動水平較低,依靠擴(kuò)大活動范圍和個體間距離逃離高被捕食風(fēng)險區(qū)。而卵群一起孵化使得個體發(fā)育同步,社會性更高,通過數(shù)量優(yōu)勢提高警惕或進(jìn)行集體防御[42],從而稀釋個體被捕食風(fēng)險并增加個體存活機(jī)率[20- 22]。