程 軍，胡 歡，張思明，耿 潔，李 峰，王飛燕，周 洲，陳 曦

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 100037)

感染性心內(nèi)膜炎(infective endocarditis，IE)是一種以心臟瓣膜受累為標(biāo)志的感染性疾病，其發(fā)病率約為3～10 例/10 萬人[1]。未得到正確、及時的治療，超過1/3 的IE 患者會在診斷后的第一年內(nèi)死亡[2]。IE 患者的預(yù)后高度依賴早期、精準(zhǔn)的抗菌藥物治療，因此，對引起IE 病原菌的鑒定至關(guān)重要。目前，IE 的診斷和抗菌藥物治療主要依賴于血培養(yǎng)及基于培養(yǎng)菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。然而，采集血培養(yǎng)前使用抗菌藥物，某些苛養(yǎng)菌或者常規(guī)方法難于培養(yǎng)的微生物引起的IE，血培養(yǎng)常呈現(xiàn)陰性的結(jié)果[3-4]。在這種情況下，可能會出現(xiàn)誤診或抗菌藥物使用不合理的情況，嚴(yán)重影響IE 患者的預(yù)后。近十幾年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，基于細(xì)菌保守序列16S rRNA 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)已經(jīng)被用于心臟換瓣術(shù)后摘除的瓣膜組織中病原體的檢測，其靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，對常規(guī)可培養(yǎng)或者苛養(yǎng)菌也有較強(qiáng)的檢測能力。然而，基于16S rRNA的PCR 技術(shù)存在天然的缺陷，如不能檢測真菌，對混合感染也是無能為力[5-6]。近幾年來，以二代測序(next-generation sequencing，NGS)為代表的宏基因組學(xué)已經(jīng)被用于直接檢測臨床標(biāo)本中的病原菌[7]。評估NGS技術(shù)直接檢測心臟瓣膜病原菌的研究在國內(nèi)外較少見，本研究以改良DUKE 標(biāo)準(zhǔn)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，直接提取心臟瓣膜組織中的DNA，旨在評價NGS技術(shù)直接檢測心臟瓣膜病原菌的能力，為IE 的診斷和術(shù)后抗菌治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及前處理 標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院2017年4月—2018年2月經(jīng)心臟瓣膜置換術(shù)或者心臟瓣膜成形術(shù)后摘除的瓣膜組織，其中28 例來自成人外科中心，2 例來自小兒外科中心。31例標(biāo)本中，根據(jù)IE 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”改良Duke標(biāo)準(zhǔn)，20例為確診IE(D．IE)患者，4例為可能IE(P．IE)患者，陰性對照為剩余的7例排除IE(re-jected IE)的心臟瓣膜病患者。實(shí)驗(yàn)室收到摘除的瓣膜組織后，立即在生物安全柜里用無菌的眼科手術(shù)剪把組織剪碎并隨機(jī)分為兩份，一份用于常規(guī)增菌培養(yǎng)，另一份(約35 mg)放置于-80℃冰箱冷凍保存，供NGS測序及Sanger測序驗(yàn)證使用。

1.2 主要儀器與試劑 哥倫比亞血平板、麥康凱平板、腦心浸液(賽默飛世爾生物化學(xué)公司)，Heal Force HF90 型CO2孵箱(上海力申科學(xué)儀器公司)，-80℃低溫冰箱(日本三洋公司)，高壓蒸汽滅菌器(山東新華公司)，BACTEK FX400 全自動血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)，Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀及配套鑒定藥敏卡，VITEK MSTM 質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)，QIAamp DNA Mini Kit(德國Qiagen 公司)，Premix TaqTM、DL2000 marker(大連TaKaRa公司)，瓊脂糖凝膠(西班牙Biowest公司)，GTQ-Cy-cler 96 擴(kuò)增儀(德國海恩公司)，DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器廠)，GIS-2010 凝膠圖像分析儀(上海天能公司)，引物及擴(kuò)增產(chǎn)物測序由中美泰和生物公司完成，二代測序及生物信息學(xué)分析由深圳華大基因研究所完成。

1.3 瓣膜培養(yǎng) 瓣膜組織在培養(yǎng)前，先用無菌的眼科手術(shù)剪盡可能的剪碎，然后加入5 mL 腦心浸液增菌，放置35℃ CO2孵箱中培養(yǎng)7 d。每日評估標(biāo)本的增菌情況，若有渾濁及時轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板、巧克力平板及麥康凱平板(賽默飛世爾公司)。未出現(xiàn)渾濁的標(biāo)本，在第7天也轉(zhuǎn)種于血平板、巧克力平板及麥康凱平板。培養(yǎng)出的微生物使用MAL-DI-TOF質(zhì)譜儀(法國VITEK 公司)進(jìn)行鑒定，使用VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(法國VITEK 公司)。

1.4 血培養(yǎng) 血培養(yǎng)的采集參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)的血培養(yǎng)臨床實(shí)踐指南(Princi-ples and procedures for blood cultures； Approved Guideline：M47A)。對疑似IE 的發(fā)熱患者，在使用抗菌藥物之前或者下次使用抗菌藥物之前(對已使用抗菌藥物的患者)從不同穿刺位點(diǎn)平均采集3 套血培養(yǎng)，采集的血液被立即注入需氧瓶和厭氧瓶(成人每瓶8～10 mL 血液，兒童每瓶1～3 mL血液)。血培養(yǎng)瓶在2 h內(nèi)被放入全自動血培養(yǎng)儀(美國BD公司)培養(yǎng)7 d，對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本及時轉(zhuǎn)種到哥倫比亞血平板、巧克力平板及麥康凱平板。微生物的鑒定和藥敏同瓣膜組織培養(yǎng)。

1.5 NGS及生信分析 冷凍的標(biāo)本恢復(fù)常溫后，用無菌的眼科手術(shù)剪剪碎。稱取約25 mg 的瓣膜組織加入蛋白酶K，消化過夜后使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA，整個操作嚴(yán)格遵照廠家的說明書進(jìn)行。提取的DNA 經(jīng)超聲波處理被破碎成200～300 bp的片段，隨后開始文庫構(gòu)建和測序，具體如下：使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段大小，Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc．)質(zhì)控DNA 文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNA 納米球。制備好的DNA 納米球加載至測序芯片，使用BGISEQ-500進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量的和長度小于35 bp的數(shù)據(jù)，以獲得

高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過BWA 比對，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中與人參考基因組序列相同的數(shù)據(jù)去除，剩下的數(shù)據(jù)用SNAP 等軟件進(jìn)一步分析，去除低復(fù)雜度reads后與NCBI的NT 數(shù)據(jù)庫比對，并將比對結(jié)果進(jìn)行Taxonomy注釋、分類，以及統(tǒng)計(jì)作圖。

1.6 Sanger測序驗(yàn)證 血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)和/或NGS檢測結(jié)果為陽性的標(biāo)本進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。Sanger測序所用的DNA 同NGS。引物由中美泰和生物公司合成。全序列引物為27f(序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(序列為：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約1 500 bp。擴(kuò)增體系為50 μL：25 μL Premix TaqTM，10 μmol/L 上、下游引物各2 μL，2 μL DNA模板，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件為：96 ℃ 150 s；96 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送中美泰和公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI Blast(http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov/B-last．cgi？PROGRAM5blastn &PAGE＿TYPE5BlastSear-ch&LINK＿LOC5blasth ome)在線比對，以相似度最高者為準(zhǔn)。比對相似度至少97%方可認(rèn)為同一菌種，不能歸到種水平的只歸到屬水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用MedCalc統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值表示。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 24 例IE 患者中，根據(jù)改良Duke標(biāo)準(zhǔn)，20例為D．IE，4例為P．IE 患者，其中男性占75．0%，平均年齡46．5歲。87．5%的IE 患者在入院前使用過抗菌藥物，非IE 患者僅占14．3%。IE 患者的C 反應(yīng)蛋白和紅細(xì)胞沉降率均高于非IE患者(均P<0．05)。見表1。IE 患者瓣膜贅生物分布為主動脈瓣12 例(50．0%)，二尖瓣4 例(16．7%)，主動脈瓣+二尖瓣3例(12．5%)、主動脈瓣+三尖瓣2例(8．3%)，未見3例(12．5%)。對照組均未見瓣膜贅生物。

2.2 革蘭染色結(jié)果 31例患者中有3例無革蘭染色結(jié)果。在18例確診IE 患者中，14例革蘭染色陽性，陽性率為77．8%，其中13例(92．9%)為革蘭陽性(G+)球菌，1例為革蘭陰性(G-)桿菌。見表2。

*： IE患者包括D.IE和P.IE的患者

2.3 培養(yǎng)結(jié)果 20例D．IE 患者中，6例患者血培養(yǎng)陽性，陽性率為30．0%，其中4 株為草綠色鏈球菌，銅綠假單胞菌和科氏葡萄球菌各1株；在D．IE患者中，3例瓣膜培養(yǎng)陽性，分別為銅綠假單胞菌、絲狀真菌和糞腸球菌，陽性率為10．0%(A5樣本從臨床癥狀、病理圖片及革蘭染色結(jié)果看，絲狀真菌高度懷疑為污染菌，未計(jì)入陽性率統(tǒng)計(jì))。見表2。

2.4 NGS結(jié)果 20例D．IE 患者中，19例NGS檢測陽性，陽性率為95．0%，其中鏈球菌16 株，五日熱八通體、貝氏柯克斯體、銅綠假單胞菌各1 株。4例P．IE 患者中，3例NGS陽性，其中鏈球菌2株，貝氏柯克斯體1 株。排除IE 的7 例病例中，NGS檢測陽性1例，為貝氏柯克斯體。所有NGS結(jié)果與Sanger測序驗(yàn)證的屬一致率為100．0%，種一致率為79．2%。

2.5 4種方法的診斷性能 革蘭染色、血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)、NGS 診斷IE 的靈敏度分別為77．8%、30．0%、10．0% 及95．0%，特異度分別為100．0%、100．0%、100．0% 及85．7%，陽性預(yù)測值分別為100．0%、100．0%、100．0% 及95．0%，陰性預(yù)測值分別為63．6%、30．0%、28．0%及85．7%。見表3。

表2 31例患者臨床診斷及主要實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

*：革蘭染色結(jié)果為查詢病歷病理科革蘭染色結(jié)果；#：根據(jù)患者臨床癥狀、病理圖片及革蘭染色，此結(jié)果高度懷疑為污染結(jié)果

表3 不同方法診斷IE的診斷效能(%)

*：2例D．IE 無革蘭染色數(shù)據(jù)，未入組本統(tǒng)計(jì)；#：1例陰性對照標(biāo)本無血培養(yǎng)數(shù)據(jù)，未入組本統(tǒng)計(jì)

3 討論

在臨床實(shí)踐中，IE 的早期診斷及針對性治療一直是個難題。通過查詢病歷及電話回訪，發(fā)現(xiàn)高達(dá)87．5%的患者收入本院前在下級醫(yī)院或者家中服用過抗菌藥物，可能是IE 早期癥狀與普通感染性疾病(如感冒)相似，造成臨床醫(yī)生或者患者誤判。采集血培養(yǎng)前使用抗菌藥物極大地影響了IE 患者血培養(yǎng)的陽性率，可能是本院IE 血培養(yǎng)陽性率低于國際平均水平的主要原因[8]。這種狀況更可突顯NGS技術(shù)在檢測IE 病原菌中的優(yōu)勢。從理論上講，只要樣本中還存在病原菌的核酸物質(zhì)，NGS技術(shù)就可以從臨床樣本中直接檢測出包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等所有類型的病原體[9]。當(dāng)然，這也預(yù)示著NGS檢測出的病原體有可能是殘留的已死亡的病原體[10-11]。即使檢出的是已死亡的病原體，對于IE患者瓣膜置換術(shù)后針對性的預(yù)防治療也至關(guān)重要。IE 患者瓣膜置換術(shù)后若不接受系統(tǒng)的、規(guī)范的抗菌治療就會存在很大的復(fù)發(fā)風(fēng)險。在研究中還發(fā)現(xiàn)相比血液、胸腔積液和尿液等無菌體液[12-13]，心臟瓣膜組織中病原體的核酸更為富集，本研究中的很多樣本病原體的reads 數(shù)能達(dá)到上千甚至十萬個數(shù)量級。

本研究中1 例樣本(A5)的瓣膜培養(yǎng)結(jié)果為絲狀真菌，而革蘭染色、NGS結(jié)果及Sanger測序均為G+球菌，臨床表現(xiàn)也不支持真菌感染，此結(jié)果應(yīng)為假陽性，很可能是由實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)種過程中污染導(dǎo)致的。樣本A16、A23 的培養(yǎng)結(jié)果均為凝固酶陰性葡萄球菌，NGS和Sanger測序是一致的，均為鏈球菌。凝固酶陰性葡萄球菌雖然也可引起IE，但是作為皮膚表面的定植菌，鏈球菌更容易被認(rèn)為是IE 的病原菌[14]。1例D．IE(A9)的病例革蘭染色、血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)、NGS 及Sanger測序卻均為陰性，可能與患者處于炎癥恢復(fù)期和/或者樣本取材的部分不合理有關(guān)。1例D．IE 的病例(A15)，瓣膜培養(yǎng)經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定藥敏儀和VITEK MS質(zhì)譜儀雙重鑒定均為糞腸球菌，NGS 和Sanger驗(yàn)證卻均為格登鏈球菌，可能與腸球菌、鏈球菌的基因序列存在較高同源性有關(guān)(早期的細(xì)菌學(xué)分類將腸球菌歸為D 群鏈球菌)[15]。1 例陰性對照樣本(A27)，臨床診斷為風(fēng)心病，血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)均為陰性，但是NGS 檢測出貝氏柯克斯體(907 條reads)。通過查詢病歷，與病理科醫(yī)生和臨床醫(yī)生深入探討，一致認(rèn)為此患者可能為風(fēng)心病引起的IE患者，臨床存在漏診的可能。如果此病例為真陽性的話，本研究計(jì)算的NGS 檢測病原菌的靈敏度和特異度將會更高。

總而言之，相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，NGS 在診斷IE時具有很多優(yōu)勢[16]，具體如下：(1)NGS 檢測IE 患者病原體的靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，尤其是對難于培養(yǎng)的苛養(yǎng)菌。本研究中NGS 檢測的苛養(yǎng)菌占總數(shù)的34．8%(包括五日熱八通體1 例、貝氏柯克斯體3例、缺陷乏氧菌4 例)。隨著NGS 技術(shù)在檢測IE 病原體上的廣泛應(yīng)用，更多未知的病原體可能會被檢出，甚至?xí)嵏踩藗儗E 病原譜的傳統(tǒng)認(rèn)識。(2)隨著NGS技術(shù)的成熟，NGS檢測病原體的周期將會縮短至2 d，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)培養(yǎng)所需的5～7 d，甚至是更長時間。(3)NGS技術(shù)能夠檢測包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲在內(nèi)的所有病原體，克服了基于16S rRNA 的傳統(tǒng)PCR 方法只能檢測細(xì)菌，對真菌或者混合感染無能為力的缺點(diǎn)。國外文獻(xiàn)[17]報(bào)道，約2%的IE 是由真菌引起的。(4)隨著大數(shù)據(jù)的應(yīng)用和生物信息學(xué)的發(fā)展，NGS技術(shù)在檢測病原體的同時還能檢測耐藥基因，對于培養(yǎng)結(jié)果陰性的IE 患者尤為重要，因?yàn)镹GS不僅可以用于IE 的診斷，還可對IE 患者的抗菌治療提供幫助。當(dāng)然，NGS作為一項(xiàng)新技術(shù)也存在很多局限性，如NGS的生信分析缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不能確定檢測的細(xì)菌是否已經(jīng)死亡，以及測序結(jié)果與疾病之間的關(guān)系尚不明確等問題。相信隨著國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的形成，NGS完整基因數(shù)據(jù)庫的建立及NGS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，這些不足或許會得到改善或者被克服，NGS在IE 的診斷和抗菌治療上將發(fā)揮更大的作用。