李軍建，陳鋼，朱千東，余正平

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

胰腺癌的惡性程度高，現(xiàn)有治療手段未能有突破性進展[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌等領(lǐng)域相繼發(fā)現(xiàn)相關(guān)異常表達的miRNA及其靶基因[4-6]。有研究表明，一些miRNA在胰腺癌中同樣存在異常表達[7]，但目前為止尚未明確發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的靶基因以及如何影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。miR-181a是人類細胞中存在較為廣泛的一類miRNA，對維持胸腺細胞分化狀態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8-9]。胰腺癌miRNA表達譜研究顯示，miR-181a在胰腺癌組織中呈現(xiàn)顯著高表達，提示miR-181a可能參與調(diào)控胰腺癌細胞的增殖凋亡[10]。miRNA數(shù)據(jù)庫靶基因預(yù)測提示ADP核糖基化輔助因子（collaborator of ADP-ribosylation factor，CARF）基因是miR-181a可能的作用靶點，該基因可通過多條途徑發(fā)揮上調(diào)p53的作用，而p53通路是胰腺癌發(fā)病機制的重要組成部分[11-12]。本研究觀察miR-181a與CARF基因的相互作用，探討兩者之間是否存靶向關(guān)系及其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺癌細胞株（Panc I）、正常胰腺細胞株（CCC-HPE-2）由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝膽胰外科重點實驗室惠贈；胰腺癌及正常胰腺組織標(biāo)本均取自于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科臨床手術(shù)切除標(biāo)本；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)（Dual-LuciferaseReporter Assay System），包括質(zhì)粒pGL-3/Control、pRL-TK，各種內(nèi)切酶及連接酶，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒等均購自美國Promega公司。細胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、100×青鏈霉素（雙抗）溶液等均購自美國Gibico公司。MTT試劑盒購自美國Sigma公司。DNA純化試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Qiagen公司，PCR相關(guān)引物合成和基因測序均委托上海生工公司協(xié)助完成。miR-181a拮抗劑（miR-181a inhibitor）和激動劑（hsa-miR-181a）及空白對照（miRNA Neg-tive Control）委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA的提取及miRNA-181a的定量檢測：采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取正常胰腺細胞株CCC-HPE-2和胰腺癌細胞株P(guān)anc I（各8個樣本），及正常胰腺組織和胰腺癌組織（各20例）中的總RNA（富集miRNA），依照Tiangen試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光實時定量PCR檢測miR-181a，以U6為內(nèi)參，其引物序列代號MS00007497，hsa-miR-181a引物序列代號MS00003213（均購自美國Ambion公司）。反應(yīng)條件為95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環(huán)，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，凝膠成像后做定量分析。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及分組：常規(guī)培養(yǎng)Panc I細胞，轉(zhuǎn)染前24 h將細胞接種于24孔板[（3～5）×105個細胞/孔]，更換孔板中培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，當(dāng)細胞匯集度約80%時開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成4 h后再更換成含胎牛血清的培養(yǎng)基，測定轉(zhuǎn)染效率。分為3組：按照通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor拮抗劑（PMI組），miRNA Negative Control陰性對照（PMNC組）和單純質(zhì)粒的空白對照（NC組）。胰腺癌組織標(biāo)本為C組，正常胰腺組織為N組，CCCHPE-2細胞為CCC-HPE-2組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖能力：將處于對數(shù)生長期的3組細胞：NC組、PMNC組、PMI組置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下，以每孔細胞數(shù)約為5×104的量接種于相應(yīng)的96孔板。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔分別加入20 μL 5 mg/mL MTT試劑，同樣條件再孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO，利用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值，上述實驗分別重復(fù)3次。

1.2.4 制備含有CARF 3’-UTR片段的pGL-3轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：采用上游引物P1（5’-ATCATACGCGTTGAATAAACCA CATCAAAGGAAAGG-3’）以及下游引物P2（5’-TGTAAGAT CTTTACGGGCAACATTTTTAAAACC-3’），用PCR法從全基因組DNA中擴增完整的CARF 3’-UTR片段P2，將純化的PCR產(chǎn)物與TAKARA pMD18-T vector連接。將包含CARF 3’-UTR片段的pGL-3質(zhì)粒和PMD-18T載體質(zhì)粒分別進行雙酶切反應(yīng)，然后混勻，離心后37 ℃常溫環(huán)境下酶切過夜。所得酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳（電壓為5 V/cm），電泳完成后將凝膠上的目的片段切下，凝膠DNA回收。所得純化pGL-3質(zhì)粒片段（60 ng/μL）和CARF 3’-UTR片段（30 ng/μL）通過T4連接酶連接。

1.2.5 熒光素酶檢測miR-181a拮抗劑和激動劑對miR-181a水平的影響：采用Trans Fast脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胰腺癌細胞Panc I，以不包含CARF 3’-UTR序列的PGL3-control質(zhì)粒作為陰性對照，單純脂質(zhì)體為空白對照，具體分組情況如下：Panc I A：PGL3-control；Panc I B：PGL3-CARF 3’-UTR；Panc I C：PGL3-CARF 3’-UTR+10 nmol/L拮抗劑（miR-181a inhibitor）；Panc I D：PGL3-CARF 3’-UTR+10 nmol/L激動劑（hsa-miR-181a）；Panc I E：PGL3-CARF 3’-UTR+30 nmol/L激動劑（hsa-miR-181a）。

上述每種處理分別設(shè)6個重復(fù)孔，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，檢測各組細胞的熒光素酶活性，結(jié)果以相對于內(nèi)對照質(zhì)粒pRL-TK的百分比表示。

1.2.6 激動劑及拮抗劑對胰腺癌細胞中miR-181a表達水平的影響：設(shè)定3個實驗組：PM組細胞（轉(zhuǎn)染10 nmol/L激動劑hsa-miR-181a上調(diào)miR-181a水平），PMI組細胞（轉(zhuǎn)染10 nmol/L抑制劑miR-181a inhibitor下調(diào)miR-181a水平）和對照組PNC組細胞（未處理），應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后各實驗組細胞中miR-181a的表達情況，檢測方法及條件參照1.2.1。

1.2.7 Western blot檢測miR-181a對CARF蛋白表達水平的影響：應(yīng)用Western blot檢測3組采用不同干預(yù)手段的細胞內(nèi)CARF基因的蛋白表達水平：PM組、PMI和PNC組。消化收集上述各組細胞，細胞裂解液提取總蛋白，制膠后總蛋白上樣50 mg，電泳跑膠（濃縮膠80 mA、20 min，分離膠120 mA、1 h），結(jié)束后取出凝膠，300 mA電轉(zhuǎn)約2 h，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF上，脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)移膜l h后加一抗，4 ℃過夜，TBST漂洗4次，然后加二抗，室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜4次，完成后電化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組間比較用t檢驗；3組間不同時間點比較用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較用S-N-K法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌中miR-181a的表達水平 C組中的miR-181a的表達量明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.015±0.010 vs. 0.003±0.002，P＜0.05）。胰腺癌Panc I細胞中的miR-181a表達水平明顯高于CCCHPE-2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.016±0.004 vs.0.006±0.002，P＜0.05）。

2.2 Panc I細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染72 h后超過80%的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞表達綠色熒光蛋白，可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染效果較佳，見圖1。

2.3 拮抗劑miR-181a inhibitor下調(diào)胰腺癌細胞的增殖水平 PMNC組各時間點間的細胞生長抑制率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PMI組的Panc I細胞在24、48、72 h等3個不同的時間點生長均受到明顯抑制，與PMNC組和NC組比較各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Panc I細胞后顯示綠色熒光（×100）

圖2 轉(zhuǎn)染后3組各時間點Panc I細胞生長情況比較

2.4 miR-181a對重組質(zhì)粒PGL3-CARF 3’-UTR熒光素酶活性的影響 Panc I A組細胞轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒PGL3-control后不影響熒光素酶活性而使其正常表達。Panc I B組細胞轉(zhuǎn)染PGL3-CARF3’-UTR與Panc I A組比熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Panc I C組細胞同時加入拮抗劑miR-181a inhibitor，細胞內(nèi)miR-181a受抑制，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與Panc I A組比，Panc I D加入10 nmol/L激動劑hsa-miR-181a，細胞內(nèi)miR-181a水平上升，熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Panc I A組比，Panc I E加入30 nmol/L激動劑hsa-miR-181a，細胞內(nèi)miR-181a水平上升，熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Panc I D與Panc I E 2組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和不同劑量的激動劑hsa-miR-181a，隨著激動劑劑量的增加miR-181a也隨之上升，熒光素酶活性明顯下降，兩者呈負相關(guān)（r=-0.92，P＜0.05）。見圖3。

2.5 激動劑及拮抗劑對胰腺癌細胞中miR-181a表達水平的影響 PM組細胞miR-181a表達水平較PNC組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.039±0.004 vs.0.015±0.004，P＜0.05）；而PMI組細胞miR-181a表達水平較PNC組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.008±0.002 vs. 0.015±0.004，P＜0.05）。

圖3 miR-181a對重組質(zhì)粒PGL3-CARF3’-UTR熒光素酶活性的影響

2.6 miR-181a水平對CARF蛋白表達的影響 與PNC組比，PM組CARF蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與PNC組比，PMI組CARF蛋白表達明顯加強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-181a對CARF蛋白表達水平的影響

3 討論

本研究證實胰腺癌組織/細胞中miR-181a的表達明顯高于正常胰腺組織/細胞；以往研究表明大多數(shù)miRNA通過改變腫瘤細胞的增殖凋亡情況，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]，結(jié)合miR-181a在胰腺癌中的高表達，采用miR-181a的拮抗劑miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞后，腫瘤細胞的增殖活性得到明顯抑制。miR-181a inhibitor的序列與miR-181a互補，可以與細胞內(nèi)成熟miR-181a序列結(jié)合，競爭靶點，從而阻斷miR-181a下調(diào)其靶基因發(fā)揮相應(yīng)功能。MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，胰腺癌細胞增殖能力顯著下降，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h等3個時間點，PMI組的細胞生長抑制率與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

由此考慮miR-181a可能通過靶向作用于某種抑癌基因，抑制其表達，從而發(fā)揮提高胰腺癌細胞增殖能力的作用。當(dāng)胰腺癌細胞中miR-181a水平下調(diào)，其相關(guān)抑癌基因得到釋放并明顯抑制腫瘤細胞的增殖。本研究結(jié)果證實上述猜想，miR-181a受抑制的PMI組胰腺癌細胞在不同時點其增殖能力均明顯下降。組內(nèi)各時間點的抑制率變化趨勢提示PMI組的抑制率與作用時間呈正相關(guān)，48 h內(nèi)抑制效果增加較為顯著，但隨后趨勢有所減緩。由此推測miR-181a inhibitor的拮抗效果隨時間的推移持續(xù)加強，但增速48 h后有所減緩。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能與轉(zhuǎn)染的miR-181a拮抗劑濃度不夠，或者胰腺癌細胞本身存在某種代償機制，抑或miR-181a拮抗劑的轉(zhuǎn)染存在一定的時效性，難以長期穩(wěn)定地在細胞中發(fā)揮作用有關(guān)，有待于進一步深入探討。

雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的作用原理是：構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞系，如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用[14]。將CARF基因3’-UTR片段克隆在熒光素酶報告基因的下游，若該片段序列內(nèi)確實存在miR-181a的作用靶點，兩者結(jié)合可降低熒光素酶活性，否則熒光素酶活性將不受影響。而作為內(nèi)對照的海馬腎熒光報告質(zhì)粒pRL-TK不受上述反應(yīng)的影響，始終能夠穩(wěn)定表達。在生物信息學(xué)靶基因預(yù)測的基礎(chǔ)上，采用雙熒光素酶報告基因技術(shù)證實CARF基因3’-UTR是否存在miR-181a的作用靶點。本研究中轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒PGL3-control的Panc I A組細胞不影響熒光素酶活性。Panc I B組細胞轉(zhuǎn)染PGL3-CARF3’-UTR后，因Panc I胰腺癌細胞本身存在miR-181a表達，其與質(zhì)粒相互作用后導(dǎo)致熒光素酶活性有所下降。當(dāng)Panc I C組細胞加入拮抗劑miR-181a inhibitor，因細胞本身的miR-181a被抑制，熒光素酶活性明顯上升；Panc I D與Panc I E兩組細胞加入激動劑hsa-miR-181a，提高了胰腺癌細胞中的miR-181a水平，熒光素酶活性隨之受到明顯抑制。上述研究結(jié)果表明miR-181a和CARF基因確實存在靶向關(guān)系，即CARF基因3’-UTR片段中包含miR-181a的作用靶點。接著還通過研究miR-181a對CARF蛋白表達水平的調(diào)控情況，進一步證實上述靶向關(guān)系。通過轉(zhuǎn)染miR-181a激動劑和拮抗劑改變胰腺癌細胞中miR-181a的水平，Western blot檢測相應(yīng)細胞組CARF蛋白表達水平的變化，實驗結(jié)果顯示細胞中miR-181a的水平與CARF蛋白表達水平呈顯著負相關(guān)。

本研究在明確miR-181a在胰腺癌中存在顯著高表達的基礎(chǔ)上預(yù)測了miR-181a和CARF的靶向關(guān)系，在獲得miR-181a與CARF基因相關(guān)性的初步證據(jù)的前提下，提出“miR-181a-CARF-p53-胰腺癌”調(diào)控途徑的猜想，并從多個角度對該假設(shè)進行驗證。隨著miRNA重要性的逐步體現(xiàn)，通過外源性干預(yù)措施改變惡性腫瘤細胞中各種miRNA水平，影響其相關(guān)靶基因的表達情況，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展應(yīng)該被考慮作為一個比較有前景的治療策略[15-17]。能否利用miR-181a和CARF的靶向關(guān)系尋找治療胰腺癌的新途徑，還有待于通過動物體內(nèi)實驗等相關(guān)研究進一步驗證。