徐 欣 周其明 張永君 張耀亭 劉中文 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學研究院，鄭州 450008)

脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)，是維生素C再生途徑的還原酶，DHAR在谷胱甘肽(glutathione，GSH)的作用下，催化氧化態(tài)的抗壞血酸DHA重新還原成抗壞血酸(L-ascorbic acid，AsA)[1]。除了從番茄中克隆到2個DHAR基因外[2]，Chen等[3]在煙草和玉米中證明增加DHAR的表達，可以提高植物體內(nèi)抗壞血酸的含量，還發(fā)現(xiàn)超量表達DHAR的轉(zhuǎn)基因植株對臭氧的抗性增加[4]。在小鼠中的同源基因是未命名蛋白產(chǎn)物和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，在家蠶中的已有研究認為此基因是 noppera-bo(nobo-Bm，GSTe7)，參與家蠶蛻皮激素的合成和幼蟲的發(fā)育，當此基因缺失時會導致幼蟲的生長發(fā)育抑制以及角質(zhì)層為光滑的表現(xiàn)[5]。但是，DHAR作為維生素C代謝途徑的關(guān)鍵酶，在柞蠶體內(nèi)迄今為止沒有相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 柞蠶品種

豫大一號，由河南省蠶業(yè)科學研究院繁育提供。

1.1.2 主要試劑

維生素C，粉劑，純度99%，Sigma公司產(chǎn)品；苯基硫脲，粉劑，純度97%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；動物組織總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Tissue Kit)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit(with gDNase))，2×Taq PCR MasterMix，瓊脂糖，GeneGreen核酸染料均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器 TGL16M高速冷凍離心機，湖南湘立科學儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀(9200型)，Applied Biosystems；UV2600紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品；1600凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

利用果蠅基因組數(shù)據(jù)庫(FlyBase)、家蠶基因數(shù)據(jù)庫(Silkworm Genome Database)、NCBI等數(shù)據(jù)庫，找到其他物種中DHAR的氨基酸序列，選擇保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，結(jié)合 PCR 引物設(shè)計原則，用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計了ApDHAR基因特異引物，并選擇 RT-qPCR 檢測的內(nèi)參基因柞蠶肌動蛋白基因(Antheraea pernyi Actin，ApA)為內(nèi)參基因(正向引物：CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA；反向引物：CAAGAATGAGGGCTGGAAGAGA)，其退火溫度為50°C，循環(huán)數(shù)為30。

1.2.2 柞蠶蛹總RNA的提取及cDNA的合成

用ddH2O把研缽、剪刀、鑷子等用具洗干凈，放在恒溫干燥箱內(nèi)，160 ℃烘烤4 h。RNA提取前，打開無菌室及潔凈工作臺內(nèi)的紫外燈消毒半小時。使用動物組織總RNA提取試劑盒，按照其說明書方法從柞蠶蛹中提取總RNA，置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書的步驟將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件確定

使用2×Taq PCR Mastermix進行PCR反應(yīng)，經(jīng)過對引物核苷酸序列的分析及不同退火溫度(45 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、55 ℃)下PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果來確定ApDHAR基因擴增的最佳退火溫度。

PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也是一個必需的參數(shù)。先94 ℃預(yù)變性3 min，再按94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min為1循環(huán)，待定循環(huán)數(shù)(26、28、30、32、34和36)后，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。由此確定ApDHAR基因擴增的最佳循環(huán)數(shù)。

PCR反應(yīng)體系：

2×Taq PCR Mastermix 12.5μL

Forward Primer，10μM 1μL

Reverse Primer，10μM 1μL

Template DNA 1μL

ddH2O to final Volume 25μL

1.2.4 電泳圖片的獲得

PCR產(chǎn)物在TAE電泳緩沖液中，以1.0%瓊脂糖凝膠、120-150 V電泳25 min，經(jīng)GeneGreen核酸染料染色后在Tanon-1600凝膠自動成像儀下觀察拍照。

1.2.5 4齡24 h注射維生素C對ApDHAR基因相對表達量的影響

根據(jù)前期試驗結(jié)果，維生素C注射劑量梯度為0 mg/g、0.01 mg/g、0.02 mg/g體重，4齡24 h柞蠶，在注射后0 h、1 h、6 h、12 h、24 h共5個時間點提取全蠶RNA，通過測定RNA的OD260/OD280結(jié)合瓊脂糖變性凝膠電泳確定RNA的純度及含量，將所有RNA樣品均稀釋到1 μg/μL，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，以各樣品cDNA為模板進行PCR擴增，采用ApA做陽性對照，對ApDHAR基因作差異性表達分析。

基因的相對表達水平以其PCR產(chǎn)物電泳條帶和ApA基因PCR產(chǎn)物電泳條帶的積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)比值表示。所有的實驗均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反轉(zhuǎn)錄cDNA模板的檢測

用ApA對提取的柞蠶蛹cDNA進行質(zhì)量檢測，電泳檢測到一條大小468 bp的條帶(圖1)，證明可以進行后續(xù)試驗。

圖1 ApA基因cDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 最佳退火溫度和循環(huán)數(shù)的確定

對于ApDHAR基因在退火溫度46～54 ℃之間每2 ℃為一個梯度，PCR產(chǎn)物均無非特異性條帶，而且在50 ℃時電泳條帶的光強度值最大(圖2左)，因此擴增的最佳退火溫度是50 ℃。

對于ApDHAR基因在24～32個循環(huán)之間每2個循環(huán)為一個梯度，PCR產(chǎn)物均無非特異性條帶，而且在32個循環(huán)時電泳條帶的光強度值最大(圖2右)，因此最佳循環(huán)數(shù)為32個循環(huán)。

圖2 不同退火溫度和循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖3 ApDHAR基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 ApDHAR基因的克隆與測序

根據(jù)引物最佳擴增條件，運用柞蠶蛹cDNA作為模板進行PCR檢測，到一條大小約860 bp的條帶(圖3)，成功克隆到ApDHAR基因，然后送公司測序(測序結(jié)果需要進一步試驗因此沒有列出)。

2.4 注射維生素C后ApDHAR基因的表達量變化

有圖4所示，在注射維生素C后1 h時，處理組表達量都比對照組降低，高劑量降低更明顯，說明體外注射維生素C能抑制該基因表達；而且至24 h抑制效果持續(xù)存在，可能與該酶參與的代謝循環(huán)較慢有關(guān)。

3 小 結(jié)

經(jīng)過多次引物設(shè)計，擴增到ApDHAR基因，在其他昆蟲中為維生素C再生途徑的還原酶，雖然本試驗初步通過RT-qPCR 檢測其功能，并發(fā)現(xiàn)體外注射維生素C能抑制該基因表達，但測序結(jié)果中其基因序列與其他基因比對結(jié)果并不理想，下一步需要運用RACE方法，擴增基因的全長，以期對基因進行較深入研究。

圖4 4齡24 h注射維生素C對ApDHAR基因相對表達量的影響