謝曉婷，李 霞，陳衛(wèi)東，彭 燦，朱光宇

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所，安徽 合肥 230016；4.馬鞍山市中心醫(yī)院，安徽 馬鞍山 243000)

甘草為豆科屬植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)、光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥的根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[1]。近年來(lái)，由于甘草中黃酮類(lèi)成分具有抗腫瘤作用[2]，甘草酸等具有抗病毒活性[3]，引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，甘草的需求量也越來(lái)越大。

甘草是多年生草本植物，由于生長(zhǎng)環(huán)境的限制，甘草主要生長(zhǎng)地在我國(guó)新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏等地，其藥用來(lái)源有野生和栽培之分，生長(zhǎng)環(huán)境的差異對(duì)甘草藥材的質(zhì)量具有一定影響[4]。

課題組前期資源調(diào)研發(fā)現(xiàn)，甘肅和新疆的甘草藥材以烏拉爾甘草為主，脹果甘草和光果甘草較少，且種子均來(lái)源于內(nèi)蒙古。因此，為探明環(huán)境差異對(duì)甘草藥材質(zhì)量的影響，本課題組從不同產(chǎn)地收集樣品，圍繞甘草的性狀、顯微特征及指標(biāo)性成分的含量開(kāi)展系統(tǒng)研究，以期為甘草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及甘草藥材的后續(xù)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

TOUPCAM顯微鏡：浙江舜宇光學(xué)科技有限公司；LC-16C高效液相色譜儀：日本島津；乙腈為色譜純：美國(guó)Sigma公司。甘草藥材采自新疆庫(kù)爾勒、甘肅蘭州，見(jiàn)表1；飲片購(gòu)自于新疆、甘肅，見(jiàn)表2。原植物標(biāo)本由安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)。

表1 藥材采集信息

表2 飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀描述 取干燥的烏拉爾甘草藥材和飲片，按2015版《中華人民共和國(guó)藥典》所載方法對(duì)甘草藥材和飲片的形狀、大小、表面、質(zhì)地、斷面、氣味等特征進(jìn)行描述。結(jié)果表明，甘草藥材性狀與2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]一致。甘肅、新疆相同生長(zhǎng)年限和采收期的甘草藥材，甘肅地區(qū)藥材根的直徑為0.6～1.5 cm，而新疆地區(qū)藥材根的直徑為1.0～3.5 cm。見(jiàn)圖1。新疆、甘肅家種飲片樣品比較，甘肅飲片的形成層環(huán)較新疆飲片更加明顯。見(jiàn)圖2。

2.2 顯微鑒別 取干燥的烏拉爾甘草藥材和飲片，按2015版《中華人民共和國(guó)藥典》的顯微鑒別法，對(duì)藥材粉末、切片進(jìn)行顯微觀察。兩地區(qū)甘草共有的顯微結(jié)構(gòu)與2015版《中華人民共和國(guó)藥典》描述一致。與甘肅家種甘草藥材相比，新疆家種甘草藥材中淀粉粒的數(shù)量略高，且新疆甘草藥材的淀粉粒平均粒徑略大于甘肅半野生甘草藥材，其他未見(jiàn)有明顯差異。見(jiàn)圖3。

圖1 甘草藥材圖(A.甘肅甘草藥材；B.新疆甘草藥材)

圖2 甘草飲片圖(A.新疆甘草飲片；B.甘肅甘草飲片)

圖3甘草藥材和飲片的粉末結(jié)構(gòu)顯微圖

兩地區(qū)樣品的根莖橫切面顯微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，與新疆野生甘草藥材相比，新疆家種甘草藥材的木栓層厚，木質(zhì)部所占根直徑的比例大，占30%～70%，維管束間間隔較小，均有裂隙；與甘肅家種甘草藥材相比，新疆家種甘草藥材的導(dǎo)管較多，排列較緊密，維管束間間隔小，其中甘肅甘草藥材木質(zhì)部所占根直徑的比例小，占20%～50%，裂隙少；此外，春季采收的甘草藥材質(zhì)地疏松，秋末采收的甘草藥材質(zhì)地堅(jiān)實(shí)。

注：A、B為新疆野生甘草藥材；C、D為新疆家種甘草藥材；E、F為甘肅家種甘草藥材

圖4甘草藥材根莖橫切面顯微圖(10×40倍)

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》方法，選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相B。按照以下程序梯度洗脫：0～8 min，19% A；8～35 min，19%～50% A，35～36 min，50%～100% A；36～40 min，100%～19% A。檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，柱溫維持30 ℃，進(jìn)樣容積20 μL，理論板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于5 000。對(duì)照品和供試品色譜圖見(jiàn)圖5。

注：S1.供試品;S2.對(duì)照品；1.甘草苷;2.甘草酸

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱定甘草粉末0.1 g(過(guò)三號(hào)篩)，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻過(guò)濾，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取甘草苷、甘草酸適量，精密稱定，加70%乙醇溶解并稀釋成甘草苷、甘草酸濃度分別為200 μg/mL、1.0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用70%乙醇溶液配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，分別以甘草苷、甘草酸濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，建立回歸方程分別為Y=50 157X-839.61(r=0.999 6)、Y=11 634X-1 220.9(r=0.999 9)。甘草苷、甘草酸在0.1～100 μg/mL、0.5～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 樣品含量測(cè)定 分別精密量取各供試品、對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 新疆、甘肅甘草中甘草苷、甘草酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果顯示，新疆、甘肅兩個(gè)地區(qū)甘草的性狀和顯微結(jié)構(gòu)均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中的描述，但是在根徑粗細(xì)、淀粉粒多寡、大小，木栓層厚度，木質(zhì)部比例及導(dǎo)管排列緊密度等方面存在差異。此外，觀察不同季節(jié)采收的甘草藥材發(fā)現(xiàn)，春初采收的藥材質(zhì)地疏松，秋末采收的藥材質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，表明甘草藥材采收期可能對(duì)甘草藥材性狀產(chǎn)生影響。兩地區(qū)甘草中甘草苷、甘草酸含量差異可能會(huì)影響藥材中有效成分的溶出，從而影響其含量的表達(dá)，對(duì)不同產(chǎn)地藥材的采收期、有效成分的提取部位的選擇有必要展開(kāi)進(jìn)一步研究。

實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，新疆、甘肅兩地區(qū)環(huán)境差異主要體現(xiàn)在溫度、濕度、土壤性質(zhì)、海拔等方面，新疆晝夜溫差大，空氣濕度較低，土壤干旱，海拔約1 000 m；甘肅晝夜溫差小，土壤濕度較高，海拔約3 000 m，故推測(cè)土壤性質(zhì)、溫度、濕度等差異對(duì)甘草藥材根徑大小、顯微結(jié)構(gòu)和易水解成分的含量產(chǎn)生影響，甘草生長(zhǎng)過(guò)程中環(huán)境變化是否會(huì)導(dǎo)致甘草藥材中成分之間的生物轉(zhuǎn)化尚有待進(jìn)一步研究。