耿元波， 王子騰, 李茹霞

(1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所， 北京 100101； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

碳是植物最重要的生命元素之一[1]。自20世紀(jì)50年代開始測定植物碳同位素豐度比以來，穩(wěn)定同位素分析取得了很大的進展，很多學(xué)者投入到植物碳同位素的研究中[2-6]。目前，植物穩(wěn)定碳同位素組成(δ13C)不僅用于植物生理生態(tài)和土壤-植物-大氣系統(tǒng)碳循環(huán)的研究，還被廣泛應(yīng)用于氣候變化的研究[7-9],因此，對植物穩(wěn)定碳同位素的研究已經(jīng)成為全球變化研究的一個重要內(nèi)容[10,11]。隨著研究的深入，穩(wěn)定碳同位素技術(shù)逐漸被用于研究植物-土壤系統(tǒng)碳循環(huán)[12-14]、植物體與環(huán)境的關(guān)系[15-17]，植物群落的動態(tài)變化[18]、土壤呼吸的動態(tài)變化及區(qū)分[19-21]、凈生態(tài)系統(tǒng)碳交換的區(qū)分[22-23]等領(lǐng)域。

C3植物凈初級生產(chǎn)力約占陸地生態(tài)系統(tǒng)的80%[24]，C3植物比C4植物虧損更多的13C[25]，C3植物的δ13C值介于-35‰～-20‰之間，平均為-27‰，C4植物的δ13C值介于-15‰～-7‰之間，平均為-13‰[26-27]，利用C3和C4植物的δ13C差異，在C3和C4植物季節(jié)性轉(zhuǎn)換的植被區(qū)，或者將C3和C4植物輪作，可以區(qū)分土壤呼吸和生態(tài)系統(tǒng)呼吸。Craig[28]于1953年首次報道了C3植物非光合組織(如根、莖等)與葉片相比存在13C富集的現(xiàn)象，Badeck等[29]發(fā)現(xiàn)C3植物根和莖與葉片相比分別存在約1.1‰和1.9‰的13C富集，Wu[30]等人用13C脈沖標(biāo)記技術(shù)來示蹤碳在根系以及根與土壤間的釋放，了解C3植物非光合組織的13C富集狀態(tài)將有助于在全球尺度上更好地利用13C來研究植物和生態(tài)系統(tǒng)。

植物δ13C能夠反映植物生長時期的環(huán)境狀況(如溫度、濕度、降水等)[31]，綜合體現(xiàn)植物光合作用過程中氣孔的傳導(dǎo)和CO2的固定，可以作為植物環(huán)境中生理機能變化的指標(biāo)，用于研究植物生理與生態(tài)環(huán)境間的關(guān)系[32]。一般認(rèn)為植物葉片δ13C值主要受植物本身遺傳因素、溫度、水分、相對濕度、光照與海拔等因素影響[33-35]，存在明顯的時空變異特征[36]，因此植物葉片δ13C可以一定程度反映小生境的環(huán)境特征，指示生態(tài)適應(yīng)策略。研究表明，在植物生長季，水分和溫度是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，也是決定干旱半干旱環(huán)境下植物δ13C變化的關(guān)鍵因子[37-38]。草地生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)最重要的組分之一，并具有對氣候變化敏感、碳收支年際波動大的特點，在全球循環(huán)和氣候變化過程中發(fā)揮重要作用[39-40]。

內(nèi)蒙古羊草(Leymuschinensis)草原是我國半干旱區(qū)最具代表性和典型性的典型草原亞類之一,是研究草原植被對全球氣候變化響應(yīng)的典型地帶[41]。目前，針對內(nèi)蒙古羊草草原碳同位素組成的研究較少，本研究在內(nèi)蒙古錫林河流域羊草草原的生長季，應(yīng)用13C脈沖標(biāo)記法，探討了羊草草原地上部活體和地下部活根中穩(wěn)定碳同位素的組成，分析了水分、溫度對羊草草原活體和活根中δ13C的影響，研究結(jié)果有助于了解氣候因子對植物中穩(wěn)定碳同位素的影響過程和機理，也可為全球氣候變化背景下草原植被穩(wěn)定碳同位素的組成和變化提供可資參考的科研資料。

1 材料與方法

1.1 研究地點概況

研究地點位于內(nèi)蒙古錫林浩特市白音錫勒牧場中國科學(xué)院內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站設(shè)置的羊草99樣地內(nèi)(43°32′ N，116°40′ E)，海拔約1 200 m。該地區(qū)屬半干旱溫帶大陸氣候，年平均(1982-2009)氣溫為0.9℃，年平均(1982-2009)降水量為334 mm，降水主要集中在生長季6～8月[42]。樣地內(nèi)建群種為根莖禾草羊草，優(yōu)勢種包括大針茅(Stipagrandis)和冰草(Agropyroncristatum)等密叢禾草，禾草以外的雜類草大多數(shù)是多年生草本植物。牧草在4月中下旬返青，生長期在150～160天左右，7-8月群落平均高度達到40～50 cm，群落覆蓋度可達40～50%[43]。土壤類型為鈣積干潤均腐土(相當(dāng)于中國土壤地理發(fā)生分類中的栗鈣土、美國土壤分類系統(tǒng)中的鈣積冷涼軟土(Calciborolls)[44-45])，土壤質(zhì)地粘粒平均為21%，砂粒為60%，為砂壤質(zhì)[46]，土層深度為100～150 cm，土壤有機質(zhì)厚達20～30 cm。

1.2 研究方法

1.2.1實驗設(shè)置 在羊草草原99樣地中，選取植被情況基本一致(不含糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)、豬毛菜(Salsolacollina)、灰綠藜(Chenopodiumglaucum)等C4植物)的樣方(50 cm×40 cm)進行13C脈沖標(biāo)記實驗，2011年進行6次實驗，2012年進行5次實驗，每次實驗設(shè)置2個處理，分別為標(biāo)記處理(13C脈沖標(biāo)記處理)和對照處理(未標(biāo)記處理)，每個處理5個重復(fù)，沿東西向展布，各占一行，對照處理樣方布置在標(biāo)記處理樣方的上風(fēng)向。每次實驗樣方數(shù)目共為10個，各樣方間距為3 m。試驗于羊草草原生長盛期進行(7-9月)，先將標(biāo)記箱底座砸入樣方土壤中，調(diào)至水平，2天后在每一個標(biāo)記樣方中央放置一個小燒杯，燒杯內(nèi)放300 mg固體Ba13CO3(豐度為98at%)，扣上標(biāo)記箱(30 cm(高)×40 cm(寬)×50 cm(長))，往底座邊槽中加入適量水，保證密封性良好。在燒杯正上方用注射器穿過密封塞(粘在箱體上方開孔處)，向燒杯內(nèi)加入3 mL略微過量的稀HCl(稀鹽酸配置按水酸比為7∶1進行)，確保Ba13CO3反應(yīng)完全，間隔約20 min打入一次普通CO2氣體以促進植物對13CO2氣體的吸收，每次注入體積約20 mL。約3 h后標(biāo)記完成，將標(biāo)記箱移除(底座留在原處，減小擾動)，讓牧草在自然條件下生長。對照樣方不做標(biāo)記處理，植被在自然狀態(tài)下生長。

1.2.2樣品采集、制備、測試和數(shù)據(jù)分析13C脈標(biāo)記完成10天后(13C在植物中分配完畢)[47]，采集標(biāo)記樣方及對照樣方的地上部活體及地下部根系樣品，每次采集時間為上午10點，同時測量此時的氣溫、15 cm土壤溫度(SN2202 型數(shù)字測溫儀，北京師范大學(xué)司南儀器廠)和0～20cm土壤水分。采樣間隔約10～15天(遇降雨時，間隔時間稍長)，2011年采集時間為7月12日、7月22日、8月1日、8月13日、8月23日、9月3日；2012年采集時間為7月16日、30日、8月13日、29日、9月9日。標(biāo)記處理樣方和對照處理樣方的植物樣品按地上部活體和地下部根系分開采集，根系取樣深度為0～20 cm，面積為25 cm×25 cm，根系依據(jù)比重不同漂洗區(qū)分出活根與死根。植物活根與植物地上部活體105℃殺青，70℃烘干，稱至恒重，準(zhǔn)確測定生物量，測后樣品粗碎混勻，四分法縮分取50 g左右用球磨機研磨至200 目，封裝常溫干燥保存?zhèn)溆?。在兩個處理各樣方中用土鉆多點采樣分別鉆取0～20 cm層次的土壤，土壤樣品量約1 kg，取部分樣品用烘干法測定土壤水分含量(烘干基)[48]，其余土壤樣品碾碎風(fēng)干四分法縮分取100 g左右用球磨機研磨至200目，封裝常溫干燥保存?zhèn)溆?。活根、地上部活體及土壤樣品δ13C(有機碳)值在中科院地理科學(xué)與資源研究所測定，測試儀器為德國Finnigan公司MAT 253 穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀，δ13C值以VPDB(Vienna Pee Dee Belemnite)為基準(zhǔn)校正，分析精密度為0.2‰。

應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Origin Pro 2016軟件作圖。采用配對樣本t檢驗檢驗兩年間對照處理和標(biāo)記處理中的地上部植物活體與植物活根δ13C之間是否存在顯著差異?；貧w趨勢線及相應(yīng)參數(shù)由Origin Pro 2016軟件直接給出，回歸因變量δ13C及自變量(土壤水分、氣溫、地溫)使用2年間對應(yīng)的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草草原地上部植物活體和地下部活根δ13C的差異及變化特征

2011年羊草草原植物生長盛期(7-9月)對照處理中地上部植物活體δ13C值介于-25.834‰～-25.076‰之間，2012年(7-9月)介于-28.000‰～-27.000‰之間，年內(nèi)相差在1‰左右，兩年間相差約3‰左右，差異均不大，2年所測的結(jié)果均落在Skrzypek等[49]給出的C3植物δ13C值范圍-35‰～-20‰之間。2011年13C脈沖標(biāo)記處理中地上部植物活體δ13C值的變化范圍在-13.942‰～16.173‰，2012年為-15.301‰～12.667‰，年內(nèi)相差在30‰左右，年間相差約31‰，差異較大。標(biāo)記處理中活體的δ13C均值和變幅都明顯大于對照處理(圖1、表1)。2011年和2012年對照處理中活根δ13C值的變化范圍分別為-24.973‰～-23.612‰和-25.969‰～-25.005‰，年內(nèi)變幅在1‰ 左右，年間變幅約2%，均比較小。2011年13C脈沖標(biāo)記處理中活根δ13C值在-23.141‰～-16.332‰之間變動，2012年在-24.140‰～-21.746‰之間，2011年內(nèi)變幅約為7‰，2012年約為3‰，年間變幅約為8%，變差均較大。在整個2年的觀測期間標(biāo)記處理中活根的δ13C均值和變幅都明顯大于對照處理，活體(圖1-A,B)與活根(圖1-C,D)在兩個處理中的δ13C值隨時間的變化趨勢基本一致，標(biāo)記與否不影響活體和活根δ13C的變化趨勢，13C脈沖標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用放大了活體與活根δ13C值在生長期內(nèi)的變化(圖1、表1)

圖1 2011、2012年羊草草原標(biāo)記處理與對照處理中活體(A,B)和活根(C,D)的δ13C值(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=5)Fig.1 The δ13C of the shoots(A,B)and the living roots(C,D)in the labeled treatments and control treatments in 2011 and 2012 (Error bars:Mean±S,n=5)

表1 2011和2012年對照處理和標(biāo)記處理中活體與活根δ13C值Table 1 The δ13C of the shoots and the living roots in control treatments and labeled treatments in 2011 and 2012 / ‰

時間Year處理Treatment活體shoots活根living roots最小值Min最大值Max平均值Mean最小值Min最大值 Max平均值 Mean2011對照處理(n=30)Control-25.83-25.08-25.62±0.45-24.97-23.61-24.47±0.69標(biāo)記處理(n=30)Label-13.9416.17-1.01±10.17-23.14-16.33-20.81±2.352012對照處理(n=25)control-28.00-27.00-27.42±0.43-25.97-25.01-25.56±0.39標(biāo)記處理(n=25)label-15.3012.67-5.58±11.11-24.14-21.75-21.32±0.91

由圖2可以看出，在2011和2012年的生長盛期內(nèi)，對照處理(圖2-A,B)及標(biāo)記處理(圖2-C,D)中活體和活根的δ13C值隨時間的變化勢均表現(xiàn)出良好的一致性，表現(xiàn)為隨時間的推移，活體和活根的δ13C值先減小再增加，隨后再減小。在對照處理中活體及活根δ13C值的變幅都不大，而標(biāo)記處理中則要大得多。在對照處理中(圖2-A,B)，活根相對于活體更容易富集13C,并且活體與活根δ13C在同一時期出現(xiàn)峰值，即8月中下旬，此時活體與活根中13C積累量達到最大，對照處理中活體δ13C顯著小于活根δ13C。經(jīng)13C脈沖標(biāo)記處理后(圖2-C,D)，活體更容易累積13C，活體δ13C顯著大于活根δ13C，并且活體的δ13C值的變幅也較活根δ13C的變幅大，活體δ13C值分布在-15‰～16‰，活根的δ13C分布在-24‰～-16‰(圖2，表1)。

圖2 2011和2012年活體和活根在對照處理(A,B)及標(biāo)記處理(C,D)的δ13C值(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差n=5)Fig. 2 The δ13C of shoots and living roots for control treatments (A,B) and13C labelled treatments (C,D) in 2011 and 2012.(Error bars:Mean±S,n=5)

2.2 水分和溫度對羊草草原地上部活體和地下部活根δ13C值的影響

2.2.1土壤水分對羊草草原活體和活根δ13C值的影響 一般情況下，C3植物δ13C值隨著降雨量或土壤水分的減少而增大，原因在于C3植物光合作用過程中，碳同位素的分餾強度與ci/ca(ci和ca分別是葉片細胞間CO2濃度和大氣CO2濃度)正相關(guān)，當(dāng)受到干旱脅迫時，植物為了避免水分蒸發(fā)而降低氣孔導(dǎo)度，使得ci/ca值變小，繼而導(dǎo)致植物δ13C增大[3,50-52]，本次研究結(jié)果也支持這一點。在對照處理中(圖3-A)，地上部活體δ13C值與0～20 cm土壤水分含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，土壤水分變化可以解釋δ13C變化的62%(R2=0.6152,P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，羊草活體δ13C降低約0.1‰。與活體一致，對照處理的地下部活根δ13C值與0～20 cm土壤水分含量之間也具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，土壤水分變化可以解釋δ13C變化的72%(R2=0.7229，P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，活根δ13C降低約0.1‰(圖3-B)。

13C脈沖標(biāo)記后(圖4-A)，標(biāo)記處理的活體δ13C與0～20 cm土壤水分之間存在顯著的二次函數(shù)關(guān)系，土壤水分的變化可以解釋活體δ13C值相應(yīng)變化的80%(R2=0.8039,P<0.05)，拋物線的拐點對應(yīng)的土壤水分值為W20=12.56%，此拐點反應(yīng)植物的最佳水分利用效率。如圖4-B，標(biāo)記處理的活根δ13C與0～20 cm土壤水分含量之間具有線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，土壤水分的變化可以解釋活體δ13C值相應(yīng)變化的44%(R2=0.4407,P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，活根δ13C降低0.15‰，通過13C脈沖標(biāo)記，使活根δ13C隨土壤水分變化更加顯著，由降低0.1‰增加到降低0.15‰，變化更加明顯。

圖3 對照處理中活體δ13C(A)和活根(B)與0～20 cm土壤水分的線性回歸圖(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=5)Fig. 3 The linear regression graph of soil moisture content in 0～20cm depth with δ13C of the shoots (A) and living roots (B) in control treatments.(Error bars:Mean±S,n=5)

圖4 標(biāo)記處理中活體(A)和活根(B)中δ13C與0～20 cm土壤水分含量的回歸圖(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=5)Fig. 4 The regression graph of soil moisture content in 0～20 cm depth with the δ13C of the shoots (A) and living roots (B) in13C labeled treatment.(Error bars:Mean±S,n=5)

2.2.2溫度對羊草草原地上部活體和地下部活根δ13C值的影響 溫度是影響植物δ13C的重要氣候因子，它一方面直接影響光合碳同化過程中的一系列酶促反應(yīng)，從而對植物碳同位素分餾產(chǎn)生影響[53]；另一方面，它也間接影響呼吸速率及氣孔對水分和CO2的擴散阻力，從而導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度(gs)和ci/ca值的變化，進而影響碳同位素分餾，最終對植物的碳同位素組成發(fā)生作用[51-52,54]。

從圖5可以看出，對照處理(A)和標(biāo)記處理(B)中羊草草原地上部活體δ13C與氣溫呈正相關(guān)關(guān)系，隨著氣溫的升高，羊草草原地上部活體δ13C增大。A中氣溫每升高1℃，活體δ13C增加0.19‰，氣溫變化可解釋活體δ13C變化的74%，B中氣溫每升高1℃，標(biāo)記的地上部活體δ13C增加1.57‰，氣溫變化可解釋活體δ13C變化的43%，13C標(biāo)記放大了活體δ13C隨氣溫變化的幅度。從決定系數(shù)看，自然狀態(tài)下(對照)溫度的變化對δ13C的影響要大于標(biāo)記處理。

圖5 氣溫與對照處理活體δ13C(A)和標(biāo)記處理活體δ13C(B)的線性回歸圖(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=5)Fig. 5 The linear regression graph of the air temperature with the δ13C of the shoots in control treatments

(A) and the13C labeled treatments (B) (Error bars:Mean±S,n=5)

兩處理中，羊草草原15 cm地溫與0-20 cm活根的δ13C均呈顯著的線性正相關(guān)關(guān)系(圖6)，即隨著15 cm地溫的升高，羊草草原地下部活根δ13C增大。如圖6-A，對照處理中土壤溫度變化可解釋活根δ13C變化的64%(R2=0.6427,P<0.05)，15 cm地溫每升高1℃,對照組活根δ13C增大約0.19‰，標(biāo)記處理中(圖6-B)土壤溫度變化可解釋活根δ13C變化的51%(R2=0.5122,P<0.05)，15cm地溫每升高1℃，地下部活根δ13C增加0.59‰。與活體類似，自然狀態(tài)下土壤溫度變化對δ13C的影響要大于標(biāo)記處理。

對照處理中，氣溫對活體δ13C值的影響與15 cm地溫對活根δ13C的影響是一致的，即溫度每升高1℃，活體與活根中δ13C增加約0.19‰，而標(biāo)記處理中，活體與活根中δ13C隨溫度的增幅都大于對照處理，氣溫對活體δ13C增幅的作用最大，單位溫度變化使δ13C增加約1.57‰。

圖6 15 cm地溫與對照處理中活根(A)和標(biāo)記處理中活根(B)的線性回歸圖(誤差線：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=5)Fig.6 The linear regression graph of the 0～15 cm soil temperature with the δ13C of the living roots in control treatments (A) and in13C labeled treatments (B) (Error bars:Mean±S)

3 討論

生長季是植物生長發(fā)育的重要時期，也是植物各種代謝活動的旺盛期。在生長旺季研究羊草草原植被中13C的組成，可以使我們更好地理解C在植物體系中的分配。本實驗通過13C脈沖標(biāo)記處理和未標(biāo)記對照處理探討了13C在羊草草原不同組分中的分配和變化情況以及水分和溫度對羊草草原13C分配的影響。

Cernusak等人[55]闡述了C3植物非光合組織(比如根、莖)與植物葉片富集13C的情況，指出相對于植物葉片，莖和根會更趨向于富集13C，并且在不同植物中富集程度不同。本試驗對照處理中，2011年活根中δ13C為-24.470‰，活體中δ13C為-25.619‰，活根δ13C比活體高1.149‰；2012年，羊草草原活根中δ13C為-25.560‰，活體中δ13C為-27.420‰，活根比活體高1.860‰。此結(jié)論表明研究區(qū)羊草草原地下部草本植物活根中13C要比地上部植物活體富集1～2‰，與Badeck等[29]人研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為植物根相比地上活體也富集13C，δ13C平均比葉片高1.1‰。

植物葉片的碳同位素組成(δ13C值)是植物葉片組織合成過程中光合活動的整合，可以反應(yīng)一定時間內(nèi)植物水分散失和碳收獲之間的相對關(guān)系[35]。研究表明，C3植物的δ13C值易受降雨量和溫度的影響，其葉片δ13C值隨降雨量和溫度的升高而顯著降低[56]。通常情況下，C3植物中δ13C值隨著降水量或土壤水分的增加而減小[3,50]，也有一些研究觀測到少量C3植物δ13C值隨著降雨量或土壤水分的增加而增加的現(xiàn)象[5,49,57]。在內(nèi)蒙古半干旱草原區(qū)，土壤水分主要受降水的影響，與降水量正相關(guān)。本試驗中，對照處理的活體和活根δ13C與0～20 cm土壤水分含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)性，標(biāo)記處理的活根δ13C與0～20 cm土壤水分含量也具有顯著負(fù)相關(guān)性，即隨著0～20 cm土壤水分的增加，對照處理的活體和活根及標(biāo)記處理的活根δ13C值都在減小。對于受13C脈沖標(biāo)記影響較大的活體來說，標(biāo)記處理中活體δ13C與0～20 cm土壤水分之間存在二次函數(shù)關(guān)系(R2=0.8039,P<0.05)，在土壤水分含量較低時，植物活體δ13C隨土壤水分含量的增加而增加，在土壤水分含量較高時隨土壤水分含量的增加而減小，表明外部大氣中13C含量較高時，土壤水分對地表草本植物活體中穩(wěn)定碳同位素分餾效應(yīng)的影響存在明顯的拐點[49-50,57]。

植物體內(nèi)碳同位素的分餾主要發(fā)生在光合過程中，因此除水分因素外，溫度也是影響植物δ13C的重要因子。本實驗中，對照處理及標(biāo)記處理中羊草草原植物的活體、活根δ13C與溫度均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，地上部活體考慮氣溫的影響，地下部活根考慮地溫的影響，即隨著氣溫和地溫的升高，活體、活根δ13C均增大。這可能是由于隨著氣溫及地溫的不斷升高，植物為避免水分過量蒸發(fā)，從而關(guān)閉部分氣孔，致使氣孔導(dǎo)度降低，ci/ca值減小，C3植物的碳同位素分餾程度相應(yīng)降低，因此植物δ13C增加[35]。

4 結(jié)論

通過兩年的野外試驗，發(fā)現(xiàn)：13C脈沖標(biāo)記處理和對照處理中活體和活根的δ13C值隨時間的變化趨勢呈良好的一致性；在高含量13C空氣中活體比活根更容易累積13C，標(biāo)記處理使δ13C值隨時間變化的趨勢更加明顯。對照處理的活體和活根及標(biāo)記處理的活根中，δ13C與0～20 cm土壤水分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，標(biāo)記處理的活體中δ13C與0～20 cm土壤水分之間存在二次函數(shù)關(guān)系。兩處理中，溫度與活體(氣溫)和活根(地溫)δ13C均呈正相關(guān)關(guān)系；對照處理中，氣溫對活體的影響與15cm地溫對活根的影響是一致的，即溫度每升高1℃，活體與活根中δ13C增加約0.19‰。經(jīng)過13C脈沖標(biāo)記，將δ13C的變化量放大，變化規(guī)律更加顯著，其中氣溫對活體的影響較大，單位溫度變化會使活體δ13C變化1.57‰。