李 波， 方志堅(jiān)， 張英俊， 李 紅， 劉瓔輝， 王玉玨， 張延琦

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100193；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院, 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生飼用豆科植物之一，具有豐產(chǎn)潛力大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，故被譽(yù)為“牧草之王”[1-2]。同時(shí)，苜蓿具有抗逆性強(qiáng)、耐瘠薄等特點(diǎn)，因此常用于改良土壤、改善生態(tài)環(huán)境等[3]。鹽害是限制苜蓿能否大面積種植的關(guān)鍵因素之一，苜蓿的耐鹽機(jī)制由特定基因型決定，且隨分化水平的變化而變化[4]。苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到不同程度的鹽堿脅迫，其中種子萌發(fā)期是植物鹽害最敏感時(shí)期，植株長(zhǎng)勢(shì)是否優(yōu)良取決于不同苜蓿品種間鹽敏感性差異，因此許多學(xué)者更加注重耐鹽苜蓿種質(zhì)資源的篩選和優(yōu)良品種的選育[5-7]。本文以5份龍牧系列苜蓿種質(zhì)資源為材料，并對(duì)其進(jìn)行不同濃度的混合蘇打鹽堿脅迫，分析各苜蓿品種萌發(fā)指標(biāo)和芽苗指標(biāo)的變化，同時(shí)運(yùn)用主成分分析和模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，建立苜蓿萌發(fā)期耐鹽堿綜合評(píng)價(jià)體系，為苜蓿耐鹽品種的選育、改良鹽堿化土地、提供優(yōu)質(zhì)蛋白飼料和鹽堿地畜牧業(yè)的發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苜蓿龍牧系列種子由黑龍江省畜牧研究所提供，苜蓿品種、編號(hào)及拉丁名見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

挑選籽粒飽滿且均勻的5種苜蓿種子，用蒸餾水浸泡2 h，將其置于鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒(12 cm ×12 cm)中，每盒50粒種子，加入20 mL不同濃度混合蘇打鹽堿溶液，以蒸餾水培養(yǎng)的種子作為對(duì)照，重復(fù)3次，將發(fā)芽盒置于HPG-280BX光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為25℃，恒重法進(jìn)行每天補(bǔ)水，以保持發(fā)芽盒內(nèi)蘇打鹽堿濃度不變。

混合蘇打鹽堿濃度：以NaHCO3和Na2CO3兩種鹽堿9∶1混合，設(shè)置蘇打鹽堿濃度為10，20，30，40，50和55 mmol·L-1，相對(duì)應(yīng)的pH分別為8.46，8.34，8.29，8.19，8.16和8.14。

種子萌發(fā)7 d后，將5種苜蓿的芽苗的地上部分和地下部分，取10株具代表性的芽苗，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量它們的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。將芽苗取出，挑選出10株具有代表性的芽苗，用吸水紙吸干芽苗上的水分后，立即稱重即為鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)，將上述以測(cè)量過(guò)鮮重(FW)的芽苗放入80℃烘箱，烘干至恒重，即為干重(Dry weight，DW)。

表1 5種苜蓿品種編號(hào)、審定年份及拉丁名Table 1 5 alfalfa variety number,approved year and Latin names

1.3 測(cè)定指標(biāo)

種子萌發(fā)期間，每天計(jì)算種子的發(fā)芽數(shù)，各指標(biāo)測(cè)定公式[8-10]如下：

種子發(fā)芽率(Germination rate，GR)=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；

種子發(fā)芽勢(shì)(Germination potential，GP)=第三天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI) = ΣGt/Dt×100%(Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)與發(fā)芽日數(shù))；

活力指數(shù)(Vigor index，VI)=發(fā)芽指數(shù)(GI)×胚根長(zhǎng)(RL)；

胚芽長(zhǎng)(Embryo length，EL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

胚根長(zhǎng)(Radicle length，RL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

鮮重(FW)=(F1+F2+F3+……+F10)/10；

干重(DW)=(D1+D2+D3+……+D10)/10；

含水量(Water content，WC)=苜蓿鮮重(FW)-苜蓿干重(DW)。

1.4 耐鹽性評(píng)價(jià)及分析

耐鹽系數(shù)=(不同蘇打鹽堿濃度處理下平均測(cè)定值/對(duì)照組測(cè)定值)×100%

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：

隸屬度的計(jì)算[11]：對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，隸屬函數(shù)公式為：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 為第i個(gè)品種第j個(gè)脅迫濃度的k項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度，Xmin、Xmax分別為k項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

權(quán)重和綜合評(píng)價(jià)D值[12]的確定：

采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)法，用公式(2)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)Vj，經(jīng)公式(3)歸一化后得到各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wj。

Vj=[Σ(Xij- (Xij)2]1/2/Xij

(2)

Wj=Vj/ΣVj

(3)

種質(zhì)耐鹽綜合評(píng)價(jià)D值的計(jì)算公式為：D=∑(Xij×Wj)

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行顯著性分析和主成分分析，用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇打鹽堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

5種龍牧苜蓿種子隨混合蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發(fā)芽率均呈下降的變化趨勢(shì)(表1)，濃度為55 mmol·L-1時(shí)，5種苜蓿種子的發(fā)芽率均為0，說(shuō)明此濃度完全抑制了苜蓿種子的萌發(fā)。低濃度(10 mmol·L-1)與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801和LM803種子的發(fā)芽率出現(xiàn)顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度下，LM806，LM807和LM808種子的發(fā)芽率高達(dá)50%以上，從發(fā)芽率的變化分析，LM806，LM807和LM808苜蓿對(duì)蘇打鹽堿的抗性高于LM801和LM803苜蓿。

5種龍牧苜蓿種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發(fā)芽勢(shì)均呈下降的變化趨勢(shì)(表1)，低濃度(10 mmol·L-1)與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的發(fā)芽勢(shì)出現(xiàn)顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，LM807和LM808種子的發(fā)芽率高達(dá)60%以上，從發(fā)芽勢(shì)的變化分析，LM807和LM808苜蓿對(duì)蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表1 混合蘇打鹽堿脅迫下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)Table 1 Seed germination rate and germination potential under mixed soda saline-alkali stress

注：同列不同小寫字母表示脅迫濃度間在0.05水平差異顯著;“-”代表在脅迫處理下種子未萌發(fā)，下同

Note:Different lowercase letters in column show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“-”indicates no germinate of seed under stress treatment,the same as below

2.2 蘇打鹽堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

5種龍牧種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發(fā)芽指數(shù)均呈下降的變化趨勢(shì)(表2)，與對(duì)照比較低濃度(10 mmol·L-1)對(duì)LM803，LM807苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)影響不大，對(duì)LM801，LM806 和LM808發(fā)芽指數(shù)的影響比較大，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的發(fā)芽勢(shì)出現(xiàn)顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度下，LM807和LM808種子的發(fā)芽指數(shù)高達(dá)50%以上，從發(fā)芽指數(shù)的變化分析，LM807和LM808苜蓿對(duì)蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803和LM806苜蓿。

除LM807苜蓿外，4種龍牧種子隨蘇打鹽堿濃度的增加，活力指數(shù)均呈下降的變化趨勢(shì)(表2)，與對(duì)照比較低濃度(10 mmol·L-1)對(duì)LM806，LM808苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)影響比較大，對(duì)LM801，LM803 和LM808的活力指數(shù)影響不大，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的活力指數(shù)出現(xiàn)顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，LM807和LM808種子的活力指數(shù)高達(dá)500以上，從活力指數(shù)的變化分析，LM807和LM808苜蓿對(duì)蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表2 混合蘇打鹽堿脅迫下種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)Table 2 Seed germination index (GI) and vigor index (VI) under mixed soda-alkali stress

2.3 蘇打鹽堿對(duì)苜蓿種子芽苗生長(zhǎng)的影響

除LM803苜蓿外，4種龍牧種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，芽苗的胚芽長(zhǎng)均呈增加的變化趨勢(shì)(表3)，與對(duì)照比較低濃度(10 mmol·L-1)促進(jìn)芽苗的生長(zhǎng)，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，5種龍牧種子的胚芽長(zhǎng)均受到不同程度的抑制；除LM803和LM808苜蓿外，LM801，LM806 和LM807 種子隨混合蘇打鹽堿濃度的增加，芽苗的胚根長(zhǎng)均呈增加的變化趨勢(shì)(表3)，與對(duì)照比較低濃度(10 mmol·L-1)促進(jìn)芽苗胚根的生長(zhǎng)，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，5種龍牧種子的胚根長(zhǎng)均受到強(qiáng)烈的抑制生長(zhǎng)，在40和50 mmol·L-1鹽堿濃度下完全抑制芽苗的生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d時(shí)，胚芽停止生長(zhǎng)甚至壞死，說(shuō)明其芽苗期對(duì)蘇打鹽堿比較敏感。

表3 混合蘇打鹽堿脅迫下種子的胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)Table 3 Embryo length (EL) and radical length (RL) under mixed soda-alkali stress

2.4 蘇打鹽堿對(duì)苜蓿種子的芽苗鮮重、干重和含水量的影響

由表4可知，LM801，LM806和LM807鮮重和干重均隨蘇打鹽堿濃度的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明蘇打鹽堿濃度為10 mmol·L-1時(shí)促進(jìn)植株對(duì)水和無(wú)機(jī)鹽離子的運(yùn)輸和吸收，而LM808的鮮重和干重隨鹽堿濃度的增加而呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)，蘇打鹽堿濃度低于40 mmol·L-1時(shí)，僅LM807還存在一定的芽苗。

除LM808的芽苗含水量外，4種苜蓿芽苗的含水量均隨蘇打鹽堿濃度的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢(shì)(表4)，由于品種間的差異和不同濃度的鹽堿脅迫形成的滲透勢(shì)不同，各品種含水量的變化幅度也不同。蘇打鹽堿濃度為10 mmol·L-1時(shí)，LM807表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸水能力來(lái)維持自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的水分，其余各品種吸水能力較差，自身生長(zhǎng)受到明顯抑制。

表4 混合蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿芽苗鮮重、干重和含水量Table 4 Fresh weight,dry weight and water content of alfalfa buds and seedlings under mixed soda saline-alkali stress

2.5 對(duì)芽苗期各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析

主成分的特征值和貢獻(xiàn)率是選擇主成分的重要依據(jù)，由表5知，在測(cè)定的9個(gè)發(fā)芽指標(biāo)和芽苗生長(zhǎng)指標(biāo)中，前2個(gè)主成分反映了總信息量的90.172%，特征值總和達(dá)到8.115，表明這兩個(gè)主成分基本上能反映苜?？固K打鹽堿能力。

表5 各指標(biāo)主成分分析的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate of principal component analysis of each index

通過(guò)對(duì)9個(gè)指標(biāo)主成分分析矩陣的計(jì)算，獲得了各指標(biāo)貢獻(xiàn)大小的特征向量見(jiàn)表6，主成分分析共得到2個(gè)主成分，主成分1中VI，GR，GI，GP，RL具有較大正載荷值，DW和EL載荷值次之，而FW和WC具有負(fù)載荷值，表明主成分1主要反映了VI，GR，GI，GP，RL等指標(biāo)，主成分2中FW，WC具有較大正載荷值，EL，DW，RL載荷值次之，即主成分2主要反映FW，WC等指標(biāo)。

表6 各指標(biāo)主成分分析矩陣和特征向量Table 6 Principal component analysis matrix and eigenvector of indicators

注：GR，GP，GI，VI，DW，F(xiàn)W，WC，EL和RL分別代表發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、干重、鮮重、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)

Note：GR，GP，GI，VI，DW，F(xiàn)W，WC，EL and RL respresent germination rate，germination potential，germination index，vigor index，dry weight，fresh weight，water content，embryo length and radicle length,respectively

2.6 對(duì)芽苗期各指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)、權(quán)重系數(shù)及D值綜合分析

根據(jù)主成分分析結(jié)果，特征向量表示各單獨(dú)指標(biāo)對(duì)總指標(biāo)的貢獻(xiàn)大小，挑選主成分中特征向量大于0.16的各指標(biāo)，主要有GR，GP，GI，VI，F(xiàn)W，WC，EL，采用隸屬函數(shù)和權(quán)重系數(shù)(Wj)對(duì)5苜蓿種子萌發(fā)期的7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果如表7，各品種耐鹽性由強(qiáng)到弱依次為：LM807>LM808>LM806>LM803>LM801。

表7 各指標(biāo)隸屬值、權(quán)重系數(shù)、綜合評(píng)價(jià)D值Table 7 The membership function value,weight coefficient and comprehensive evaluation D value of each index

3 討論

苜蓿種子在不同的鹽堿條件下萌發(fā)率高低是其能否在鹽堿環(huán)境中生存的基礎(chǔ)[13]。但一項(xiàng)指標(biāo)無(wú)法全面無(wú)誤地反映品種耐鹽堿性萌發(fā)的強(qiáng)弱，所以選取發(fā)芽率等多項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，來(lái)分析在種子萌發(fā)期耐鹽的品種[14]。萌發(fā)率能直接的反應(yīng)種子耐鹽堿脅迫的基礎(chǔ)，研究結(jié)果與古麗內(nèi)爾·亞森等[15]人的研究成果一致，鹽生植物在低鹽度和蒸餾水中的種子萌發(fā)率沒(méi)有顯著的差異，但是隨著鹽度的增高，其萌發(fā)率下降。其中種子活力指數(shù)既能反映種子的發(fā)芽率，又能客觀反映種子的萌發(fā)質(zhì)量[16]。種子這4項(xiàng)數(shù)據(jù)同時(shí)保持較高的值，才能證明種子能快速、整齊的萌發(fā)，并保持幼苗的粗壯。

從根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重、干重、含水量上分析，在低濃度脅迫下根的生長(zhǎng)發(fā)育受到促進(jìn)作用，使根系能夠保持相對(duì)高于對(duì)照組根系的活力，維持高水平的吸收、運(yùn)輸?shù)裙δ?，增加根的吸水能力，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，使快速的發(fā)育、伸長(zhǎng)；高濃度的鹽堿脅迫下，苜蓿幼苗生長(zhǎng)緩慢，有的開(kāi)始衰亡、腐爛，這與王素平等[17]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，植物根系總吸收面積受到一定抑制、質(zhì)膜透性升高并伴隨吸水能力下降，使葉片相對(duì)含水量下降，從而導(dǎo)致光合速率降低，鹽脅迫對(duì)植株的傷害加重[18-19]。

通過(guò)主成分分析可知，GR，GP，GI，VI，F(xiàn)W，WC，EL等指標(biāo)可以較好得反映龍牧苜蓿品種的抗鹽性，利用隸屬函數(shù)法，賦予7個(gè)萌發(fā)指標(biāo)以權(quán)重，通過(guò)矩陣運(yùn)算和綜合排序可知，LM807的綜合D值最高，LM801的綜合D值最低，表明龍牧807苜蓿的耐鹽堿性最強(qiáng)，龍牧801苜蓿的耐鹽堿性最弱，研究結(jié)果與田小霞等[20]人對(duì)苜蓿屬植物苗期耐鹽指標(biāo)篩選及耐鹽性綜合評(píng)價(jià)所得到的結(jié)果相似，利用D值對(duì)龍牧苜蓿種質(zhì)資源的耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，解決了植物耐鹽性評(píng)價(jià)方法中多個(gè)指標(biāo)之間無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)一比較的問(wèn)題，對(duì)龍牧苜蓿種質(zhì)資源的耐鹽堿性予以準(zhǔn)確、科學(xué)的評(píng)價(jià)。這與前人在番茄[21]、披堿草[22]、花椰菜[12]等植物耐鹽性評(píng)價(jià)中的發(fā)現(xiàn)類似，這種綜合評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建為耐鹽堿性優(yōu)質(zhì)牧草的選育提供一定依據(jù)。

4 結(jié) 論

5種龍牧苜蓿種子在混合蘇打鹽堿脅迫下，低濃度(10 mmol·L-1)對(duì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)影響比較小，對(duì)芽苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，而在蘇打鹽堿濃度超過(guò)30 mmol·L-1時(shí)，對(duì)種子的萌發(fā)和芽苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用。5種龍牧苜蓿種質(zhì)資源的耐鹽堿性由高到低依次為：龍牧807苜蓿>龍牧808苜蓿>龍牧806苜蓿>龍牧803苜蓿>龍牧801苜蓿，為蘇打鹽堿地選擇適種苜蓿品種提供一定的科學(xué)依據(jù)。