吳明澤 王 笑 胡祥昊 馬青琳 李亞男 董丹華 高 鵬 代 龍

(山東中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，山東 濟南 250355)

中華圓田螺俗名田螺、香螺，屬軟體動物門腹足綱田螺科圓田螺屬[1]，廣泛分布于稻田、湖泊、沼澤、河流、小溪等處，是淡水螺中較大型的食用螺[2]。田螺肉豐腴紅膩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，每100 g內含蛋白質18.2 g、脂肪0.6 g，還有磷、鈣、鐵、VB以及豐富的VA等，是典型的高蛋白、低脂肪的天然保健食品[2]。鄭漢豐等[3]研究表明，中華圓田螺肉富含人體必需的8種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比例均在35%左右，與WHO/FAO模式推薦的模式(35.38%)接近。

氧化應激是指機體內產生過多活性氧簇(ROS)自由基，超出機體清除能力，導致體內氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡[4]。而體內氧化還原狀態(tài)失衡與慢性代謝性疾病，如心腦血管疾病、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎和癌癥發(fā)生、發(fā)展等[5-6]有關。目前，中華圓田螺資源開發(fā)集中在普通食品及飼料行業(yè)，楊麗麗等[1]已發(fā)現(xiàn)中華圓田螺抗菌肽對人體肺腺癌細胞A549細胞的生長抑制作用，但對其他生物活性尤其是抗氧化活性的研究開發(fā)尚未見報道。

試驗擬在前期研究的基礎上，通過堿性蛋白酶、胰蛋白酶進行雙酶酶解制備中華圓田螺肽，采用超濾、大孔樹脂、葡聚糖凝膠色譜和半制備液相色譜對其進行分離純化，以1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除率、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧化自由基吸收能力(ORAC)為指標，進行活性追蹤，制備獲得活性較高的抗氧化肽，并通過小鼠體內抗氧化酶及MDA增加值的測定驗證其體內抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

中華圓田螺：山東省濟寧市微山湖田螺養(yǎng)殖場；

胰蛋白酶、堿性蛋白酶：1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

昆明種封閉群小白鼠：動物合格證號SCXK(魯)2017-0011，雌雄各半，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)Elisa試劑盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒：武漢純度生物科技有限公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)：美國Secoma公司；

熒光素鈉(Fluorescein 2Na)、ABTS、DPPH：美國Sigma公司；

2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、還原型谷胱甘肽、水溶性VE：北京Solarbio公司；

超濾管：1 000，3 000 Da，美國Millipore公司；

葡聚糖凝：Sephadex G-10型，北京Solarbio公司；

大孔樹脂：DA201-C型，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設備

電腦自動部分收集器：BS-110型，上海精科實業(yè)公司；

高速組織搗碎機：JJ-2型，上海谷寧實業(yè)有限公司；

膜分離設備：1812型，杭州瑞納膜工程有限公司；

精密增力電動攪拌器：JJ-1型，江蘇省金壇市宏華儀器廠；

冷凍干燥機：FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

半制備液相色譜系統(tǒng)：LC-20A型，日本島津株式會社；

紫外—可見分光光度計：UV-1800型，日本島津株式會社；

分析天平：XS105型，瑞士Mettler Toledo公司；

高速冷凍離心機：GL-21M型，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 田螺肉酶解液的制備 取田螺在水中滴加3滴香油養(yǎng)殖3 d，80 ℃水煮田螺15 min，充分洗凈后，挑出田螺肉，置于冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。稱取田螺肉1 kg，加水5 000 mL 勻漿，85 ℃加熱15 min，冷卻，采用胰蛋白酶、堿性蛋白酶酶解，酶解條件為pH 9、酶解溫度55 ℃、每種酶的酶用量3 000 U/g，酶解時間3 h，酶解結束后，酶解液在85 ℃下加熱10 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液凍干以獲得酶解產物，使用前將其冷凍在-20 ℃ 下保存。

1.2.2 田螺肉中抗氧化肽的分離純化

(1)超濾分段：取酶解液凍干粉，用水復溶，通過1 000，3 000 Da超濾膜分段為<1 000，1 000～3 000，>3 000 Da 3個部分，將凍干粉配制成1，2 mg/mL 溶液，測定各部位的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，篩選出活性最強的部位進行下一步分離純化。

(2)大孔樹脂分離純化：取超濾后體外活性最強的部位凍干粉用水復溶，濃度為10 mg/mL，將處理好的DA201-C大孔樹脂裝柱(16 mm×190 mm)，樣品上柱。大孔樹脂柱分別用3 BV的去離子水、50%乙醇、75%乙醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，收集各洗脫部位，濃縮凍干后配制為1，2 mg/mL溶液，測定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，篩選出活性最強的部位進行下一步分離純化。

(3)凝膠過濾色譜的分離純化：去大孔樹脂純化后活性最強的部位凍干粉用水復溶，濃度為25 mg/mL，將處理好的Sephadex G10裝柱(20 mm×100 mm)，樣品上柱。先用去離子水平衡色譜柱，然后進行洗脫，洗脫溶劑為去離子水，洗脫流速為1 mL/min，2 mL收集一支EP管，在280 nm下檢測其吸光度，收集各洗脫峰，濃縮并凍干制備成1，2 mg/mL溶液，測定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，選擇活性最強的部位進行下一步的分離。

(4)半制備液相色譜的分離純化樣品：凝膠過濾色譜所得最強活性部位凍干粉，用水復溶，過0.22 μm的微孔濾膜，制備樣品，進半制備液相。參考王少平等[7]的色譜條件進行半制備液相色譜分離純化，收集各洗脫峰，凍干后制備為1 mg/mL溶液，檢測其肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)確定活性最強的部位。

1.2.3 肽純度檢測 將半制備液相色譜分離獲得的活性最強部位，過0.45 μm濾膜后，利用分析型高效液相色譜儀檢測其純度。檢測條件為：BAX-ZOR300SB-C18柱(150 mm×6 mm，5 μm)，流動相A：0.1% 三氟乙酸(TFA)；流動相B：乙腈+0.1% TFA；梯度洗脫：0～50 min，5% B～50% B；50～65 min，50% B～95% B；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。

1.2.4 田螺肽的活性檢測

(1)DPPH自由基清除率的測定：根據(jù)Samad等[8]的測定方法，將2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(溶劑為無水乙醇)和2 mL待測溶液混勻。在室溫暗處靜置30 min后，測量其在519 nm處的吸光度At。測定混有蒸餾水的待測溶液的吸光度Ar以及DPPH溶液的吸光度A0。DPPH自由基清除率c根據(jù)式(1)計算。

(1)

(2)ABTS自由基清除率的測定：參照Dauthal等[9]用ABTS和過硫酸鉀制備自由基溶液，以2.45 mmol/L的終濃度稀釋在水中，并且在黑暗中放置16 h以允許自由基生長，稀釋溶液以在734 nm處達到約0.7的吸光度Ao，將0.96 mL ABTS+自由基溶液與0.04 mL各樣品混合，734 nm處反應3 min后測量吸光度Ai，使用去離子水作為空白。ABTS自由基清除率d根據(jù)式(2)計算。

(2)

(3)鐵離子還原能力的測定：參照郭曉青等[10]的方法并加以改進。在反應管中加入100 μL待測液，再加入2.4 mL FRAP工作液，37 ℃水浴10 min，于593 nm 處測定吸光度。以0.1～1.6 mmol/L的FeSO4標準液替代樣品繪制標準曲線。以1.0 mmol/L的FeSO4為標準，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度值為一個FRAP值，計算結果。

(4)ORAC的測定：參照戴慧卿等[11]的方法，將供試品熒光衰減曲線下的保護面積代入Trolox方程，得到供試品的ORAC，結果用Trolox濃度表示。

(5)肽含量的測定：在反應管中加入1 mL待測液，再加入1 mL堿性銅試劑和4 mL福林酚試劑，55 ℃下反應5 min，冰水浴10 min，于650 nm處測定吸光度。以0.0～0.2 mg/mL牛血清白蛋白的標準液替代樣品繪制標準曲線，利用標準曲線計算結果。

(3)

式中：

w——肽含量，%；

c——待測液濃度(根據(jù)標準曲線計算)，mg/mL；

V——待測液體積，mL；

m——待測物質量，mg。

1.2.5 田螺肽的體內抗氧化活性檢測

(1)小鼠飼養(yǎng)及訓練條件：小鼠按照體重隨機分組，共5組，1個空白組、3個試驗組和1個陽性對照組。日常自由飲食，灌胃飼養(yǎng)40 d，運動前1.5 h灌胃，空白組灌胃雙蒸水，試驗組灌胃中華圓田螺抗氧化肽，陽性對照組灌胃谷胱甘肽，飼喂量為小鼠體重的3%。每日游泳訓練1次，不負重，每次30 min，水溫(30±2)℃。

(2)血清、組織勻漿的制備及指標檢測：參照文獻[12]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進行顯著性差異分析，方法為Duncan multiple，P<0.05為差異顯著。采用Origin 2017b進行作圖[13]。

2 結果與分析

2.1 田螺肽的分離純化

2.1.1 超濾 如圖1所示，各項指標隨樣品濃度的增加而增大。在濃度為2 mg/mL時，<1 kDa部位的DPPH自由基清除率為76.81%，顯著高于其他兩個部位(P<0.05)；兩個濃度下，<1 kDa部位的ORAC均顯著高于另外兩個部位(P<0.05)，<1 kDa和1～3 kDa部位的ABTS自由基清除率和FRAP相當且均高于>3 kDa部位的。分子量較小的<1 kDa部位具有良好的捕捉DPPH、ABTS自由基電子的能力及還原物質的能力。

2.1.2 大孔樹脂分離純化 將<1 kDa部位經DA201-C大孔樹脂分離為水、50%乙醇、75%乙醇洗脫部位。由圖2 可知，各指標均隨樣品濃度增大而增大，在1，2 mg/mL 下水洗脫部位的DPPH自由基清除率分別為57.23%，80.14%，F(xiàn)RAP分別為0.387，0.734，ORAC分別為854.23，1 576.76 μmol/L，均顯著高于其他兩個部位的(P<0.05)；ABTS自由基清除率分別為48.27%，88.23%，與75%乙醇部位的相當。以上表明，經大孔樹脂分離的極性較大的<1 kDa水部位具有較強的抗氧化能力。

2.1.3 凝膠過濾色譜分離純化 由圖3可以看出，水洗脫部位經Sephadex G-10分離后被分成了3個部位。

由圖4可以看出，3個部位的各項指標隨著樣品濃度增大而增大。峰2的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、FRAP、ORAC在1，2 mg/mL時都為最大，分別為61.28%，89.21%；55.29%，90.87%；0.409，0.816；902.67，1 632.45 μmol/L，均顯著高于其他部位的(P<0.05)。結果表明峰2部位具有較強的抗氧化能力。

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.4 半制備液相色譜純化 由圖5可知，凝膠過濾色譜得到的2號峰經過半制備液相色譜分離純化后被分成了4個部位。

由圖6可知，在酶解液濃度1 mg/mL時，峰2的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率最強分別為60.42%，54.96%；ORAC也最高，為932.58 μmol/L，且均顯著高于其他組(P<0.05)；FRAP低于峰3，為0.378。以谷胱甘肽為陽性對照，1 mg/mL谷胱甘肽溶液的DPPH自由基清除率為65.29%，ABTS自由基清除率為62.09%，F(xiàn)RAP為0.599，ORAC為937.37 μmol/L。峰2的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率略低于谷胱甘肽，ORAC與谷胱甘肽相當。ORAC法是基于氫原子轉移的反應，目前氫原子轉移反應被認為是自由基氧化反應的主要機制[14]，因此，峰2為抗氧化活性最強的部位。

圖3 1 kDa部位凝膠過濾色譜圖

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖5 半制備液相色譜分離色譜圖

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 抗氧化肽純度

所得肽段經肽含量測定為(78.65±2.02)%，如圖7所示，半制備液相色譜所得2號峰主要為1個大峰，通過歸一化法計算得到峰面積占比達到90%以上，說明通過分離純化最終得到一個純度較高的抗氧化肽片段[15]。

圖7 分析液相色譜圖

2.3 抗氧化肽的體內抗氧化活性

由圖8可知，試驗組小鼠的血清中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)的活力與空白組相比均增大，且差異顯著(P<0.05)，除GSH-PX外，試驗組與谷胱甘肽陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，表明各種抗氧化酶在體內均發(fā)揮了與谷胱甘肽相當?shù)囊种谱杂苫淖饔谩Ｔ囼灲M的MDA生成量明顯低于對照組，且與谷胱甘肽相當，以上表明中華圓田螺抗氧化肽具有顯著的體內抗氧化活性。

同一項目小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

對中華圓田螺肉堿性蛋白酶、胰蛋白酶雙酶酶解液進行分離純化，經超濾、大孔樹脂、凝膠過濾色譜和半制備液相色譜分離后，獲得了一個純度和體外抗氧化活性均較高的肽段。試驗對中華圓田螺肽中抗氧化活性肽進行了研究，據(jù)多項研究表示，抗氧化活性與多種氨基酸的作用息息相關，如亮氨酸等疏水性氨基酸[16]，而中華圓田螺中有含量較高的亮氨酸[17]，此外，多種氨基酸構成的小肽比氨基酸活性更強，可能與機體更高的相容性、易吸收及氨基酸的相互作用有關[18]。但試驗針對中華圓田螺分離純化所得抗氧活性肽未進行肽序測定及接下來的活性研究，對于體內活性測定的指標較為簡單，還需進一步研究。