侯云飛 徐德平

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

仙靈脾又名淫羊藿、千兩金、放杖草等，為小檗科淫羊藿屬多年生多種草本植物的根的統(tǒng)稱，被衛(wèi)生部確定可用于保健食品的原料，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有延緩衰老[1]、增強(qiáng)記憶[2]、激素及免疫調(diào)節(jié)[3]等功效。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)仙靈脾的報(bào)道很多，主要集中在抗疲勞方面[4]，但嚴(yán)金玲等[5]研究表明仙靈脾水提物具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，抑制小鼠自發(fā)活動(dòng)，同時(shí)縮短睡眠潛伏期，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間。付立波等[6]利用腦立體定位技術(shù)進(jìn)行仙靈脾總黃酮(TFE)的側(cè)腦室微量注射，通過(guò)多導(dǎo)睡眠描記術(shù)(PSG)對(duì)大鼠睡眠進(jìn)行觀察，結(jié)果表明TFE可促進(jìn)睡眠，一直覺(jué)醒，即TFE具有明顯的中樞抑制作用[7]。

現(xiàn)有的相關(guān)研究著重于仙靈脾的粗提取物上，有關(guān)仙靈脾助眠具體功效成分未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)旨在運(yùn)用色譜分離及小鼠睡眠[8]、自主活動(dòng)[9]試驗(yàn)，從仙靈脾中篩選出助眠的功能成分，為仙靈脾作為助眠藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

仙靈脾：市售；

無(wú)水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸、正丁醇、二甲亞砜等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺(tái)芝罘化工廠；

AB-8型大孔吸附樹(shù)脂：天津南開(kāi)大學(xué)化學(xué)工廠；

中壓色譜分離凝膠(MCI GEL)填料：三菱化學(xué)公司；

C18色譜柱(ODS)填料：日本Tosoh公司；

雌雄ICR小鼠(體重18～22 g)：上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

龍視安攝像頭：LS-Q130W-1型，廣東東莞市盛鼎電子科技有限公司；

磨粉機(jī)：GLF-205型，浙江省溫州市創(chuàng)立藥材器械廠；

萃取罐：RAT-100型，無(wú)錫申科儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-1002型，上海申順生物科技有限公司儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，江蘇省金壇市榮華儀器廠；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術(shù)公司；

暗室紫外投射儀：ZF-90型，上海顧順電光儀器廠；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，德國(guó)Bruker公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 仙靈脾提取物制備與粗分離 稱取仙靈脾10 kg，粉碎后過(guò)40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(g/mL)料液質(zhì)量體積比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取4 h，過(guò)濾，取濾液，濾渣按上述方法再次醇提，取濾液。合并兩次濾液，減壓濃縮至適宜體積，即為仙靈脾乙醇提取物，-20 ℃下冷凍保存。向仙靈脾醇提后的濾渣中按上述方法加100 L 去離子水，并于70 ℃條件下攪拌4 h，重復(fù)提取兩次，過(guò)濾，取濾液減壓濃縮至膏狀物，即為仙靈脾水提物。將仙靈脾醇提物和水提物合并，即為仙靈脾混合提取物。

取適量仙靈脾混合提取物上AB-8型大孔樹(shù)脂柱(10 cm×150 cm)[10]，依次用水和30%，50%，70%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤監(jiān)測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果將具有相同成分的洗脫液合并，將洗脫液分成A(水洗脫)、B(30%洗脫)、C(50%洗脫)和D(70%洗脫)4個(gè)部分。分別減壓濃縮后，-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 仙靈脾粗分物改善睡眠的作用 試驗(yàn)100只SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄兼用，體重為(18±4)g，許可證編號(hào)SYXK(蘇)2016-0045。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組20只。試驗(yàn)組以1.0 g/kg·BW劑量分別一次性灌胃A、B、C、D，空白組灌胃同體積蒸餾水，連續(xù)灌胃14 d后，展開(kāi)試驗(yàn)。試驗(yàn)在24～25 ℃安靜環(huán)境下進(jìn)行。

(1)自主活動(dòng)儀測(cè)試試驗(yàn)：于末次給藥30 min后，將小鼠置于自主活動(dòng)儀內(nèi)，適應(yīng)5 min后測(cè)定小鼠10 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)，自主活動(dòng)記錄儀記錄小鼠活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)，作為評(píng)價(jià)小鼠活動(dòng)情況的指標(biāo)[11]。

(2)直接睡眠試驗(yàn)：參照胡超群等[12]的方法進(jìn)行直接睡眠試驗(yàn)。自主活動(dòng)試驗(yàn)24 h后進(jìn)行直接睡眠試驗(yàn)[13]，于末次給藥30 min后觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，記錄30 min內(nèi)各組入睡動(dòng)物數(shù)及12 h小鼠睡眠時(shí)間。

1.2.3 大孔樹(shù)脂洗脫活性組分的分離 將含有改善睡眠功效的B組分上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用20%，30%，40%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速8 mL/min，自動(dòng)收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分[14]，根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果，分析合并相同組分，得到L(20%)、M(30%)和N(40%)3個(gè)組分。

1.2.4 MCI柱各洗脫組分改善睡眠活性的檢測(cè) 按1.2.2 方法對(duì)MCI柱分離得到的L、M、N進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，分析各組分改善睡眠的作用。

1.2.5 改善睡眠活性成分的分離與鑒定 將具有改善睡眠活性的M組分反復(fù)上樣到ODS-D柱(3 cm×100 cm)、ODS-A柱(3 cm×100 cm)和 ODS-AQ 柱(3 cm×100 cm)，直至得到4個(gè)單體成分，用氘代二甲亞砜溶解進(jìn)行1H NMR和13C NMR等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

1.2.6 單體成分改善睡眠的功效 將4個(gè)單體成分按2.2 的方法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，判定4個(gè)單體成分的改善睡眠功效。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)結(jié)果以SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x±s)表示，采用One Way-ANOVA檢驗(yàn)，直接睡眠試驗(yàn)以入睡動(dòng)物計(jì)數(shù)資料并經(jīng)x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂粗分物改善睡眠活性分析

經(jīng)灌胃14 d后，大孔樹(shù)脂粗分物各組小鼠睡眠率、睡眠時(shí)間及自主活動(dòng)情況的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，各給藥組中，B組較空白組30 min入睡率有顯著提高(P<0.05)，睡眠時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，延長(zhǎng)率達(dá)到17.38%；在自主活動(dòng)方面，B組小鼠活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)顯著低于空白組(P<0.05)，其中雄鼠活動(dòng)次數(shù)極顯著減少(P<0.01)。說(shuō)明B(大孔樹(shù)脂30%乙醇洗脫組分)組具有改善睡眠的活性成分，并且該組分對(duì)雌雄鼠都具有一定的作用。因此，對(duì)大孔樹(shù)脂30%乙醇洗脫物進(jìn)一步分離純化。

2.2 MCI柱各洗脫組分改善睡眠活性的檢測(cè)

大孔樹(shù)脂30%乙醇洗脫物MCI分離后的各組分改善睡眠功效見(jiàn)表2。以30 min內(nèi)入睡動(dòng)物為計(jì)數(shù)資料，結(jié)果經(jīng)x2檢驗(yàn)，只有M組與空白組有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅M組較空白組睡眠時(shí)間增長(zhǎng)，有極顯著性差異(P<0.01)。且M組與空白組活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)相比較，呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。其他各組較空白組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。雌雄鼠均無(wú)差異。故可判定仙靈脾改善睡眠功效成分主要存在于MCI柱層析30%乙醇洗脫物中。

2.3 單體成分的鑒定

MCI柱層析分離得到具有助眠活性的M組分，經(jīng)進(jìn)一步分離得到4個(gè)主要成分單體。成分Ⅰ為黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅱ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅲ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅳ黃色粉末狀，可溶于水、乙醇和甲醇。

表1 仙靈脾各組分對(duì)小鼠睡眠和活動(dòng)情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

表2 仙靈脾各組分對(duì)小鼠睡眠和活動(dòng)情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

由表3可知：

(1)成分Ⅰ：δ7.96，7.17各有2H，形成AA′BB′系統(tǒng)，表明含有苯環(huán)對(duì)位取代，δ6.68為單峰H，δ5.43，5.21，5.18為糖的端基H信號(hào)，說(shuō)明成分含有3個(gè)糖基，δ3.90 為OMe，δ1.75、1.64，1.14，0.85共有4個(gè)甲基信號(hào)。成分Ⅰ共有38個(gè)碳信號(hào)，其中糖上18個(gè)碳信號(hào)，并有1個(gè)異戊烯基，余下15個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)為黃酮類成分，參照文獻(xiàn)[15]鑒定為朝藿定C。

(2)成分Ⅱ：δ7.90，7.13各有2H，δ6.64 為單峰H，δ5.29，5.17，5.01為糖的端基H信號(hào)，說(shuō)明成分含有3個(gè)糖基，δ3.86為OMe，δ1.69，1.61，0.81為3個(gè)。成分Ⅱ共有37個(gè)碳信號(hào)，其中糖上17個(gè)碳信號(hào)，并有1個(gè)異戊烯基，余下15個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)為黃酮類，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是連接的糖鏈不同，含有1個(gè)木糖基，參照文獻(xiàn)[16]鑒定為朝藿定B。

(3)成分Ⅲ：δ7.91，7.14各有2H，δ6.64 為單峰H，δ5.18，5.02為糖的端基H信號(hào)，說(shuō)明成分含有2個(gè)糖基，δ3.86 為OMe，δ1.69，1.62，0.82為3個(gè)甲基信號(hào)。成分Ⅲ共有32個(gè)碳信號(hào)，其中糖上12個(gè)碳信號(hào)，并有1個(gè)異戊烯基，余下15個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)為黃酮類成分，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是只有2個(gè)糖基信號(hào)，參照文獻(xiàn)[17]鑒定為淫羊藿苷。

(4)成分Ⅳ：δ7.98，7.22各有2H，δ6.69為單峰H，δ5.07為糖的端基H信號(hào)，說(shuō)明成分含有1個(gè)糖基，δ3.96為OMe，δ1.71，1.69為2個(gè)甲基信號(hào)。成分Ⅳ共有26個(gè)碳信號(hào)，其中糖上6個(gè)碳信號(hào)，并有1個(gè)異戊烯基，余下15個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為黃酮類成分，該成分與成分Ⅰ相似，不同的是只有1個(gè)糖基信號(hào)，參照文獻(xiàn)[18]鑒定為淫羊藿次苷。

朝藿定C的R基為Rha-Rha；朝藿定B的R基為Rha-Xyl；淫羊藿苷的R基為Rha；淫羊藿次苷R基為H

圖1 4種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Figure 1 The chemical structures of compounds I，II，III and Ⅳ

表3 成分I、II、III、Ⅳ 的13C 核磁共振數(shù)據(jù)

2.4 對(duì)單體成分改善睡眠功效分析

從表4可以看出，與空白組相比，成分Ⅱ和Ⅳ在睡眠及自主活動(dòng)指標(biāo)方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；成分Ⅰ雌雄鼠睡眠率提高了10%，雌雄鼠睡眠時(shí)間分別延長(zhǎng)了117.3，136.9 min(P<0.01)，雌雄鼠活動(dòng)次數(shù)分別減少88.9，88.8次(P<0.05)，雌鼠站立次數(shù)減少69.8次(P<0.05)，且雄鼠的站立次數(shù)極顯著減少95次(P<0.01)；成分Ⅲ雌雄鼠均可顯著提高入睡率，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，抑制小鼠自主活動(dòng)次數(shù)(P<0.05)。說(shuō)明成分Ⅰ(朝藿定C)具有顯著改善睡眠作用，成分Ⅲ(淫羊藿苷)也有較好的作用。

表4 4種成分對(duì)小鼠睡眠和活動(dòng)情況的影響?

? *.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**.與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。

近年來(lái)大量文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道仙靈脾具有預(yù)防阿爾茨海黙癥和改善學(xué)習(xí)記憶的作用，這種改變與神經(jīng)和中樞膽堿能系統(tǒng)有著密切的關(guān)系。同樣睡眠的變化與中樞神經(jīng)是相關(guān)的，試驗(yàn)結(jié)果反映出仙靈脾具有影響中樞神經(jīng)功能，與付立波等[22]認(rèn)為仙靈脾增加中樞的γ-氨基丁酸(GABA)含量或抑制GABA轉(zhuǎn)氨酶的活性，均可增加深睡眠和減少快速眼動(dòng)睡眠研究結(jié)論相似。

3 結(jié)論

仙靈脾提取物大孔樹(shù)脂30%乙醇洗脫組分具有促進(jìn)睡眠功能，該組分經(jīng)MCI分離發(fā)現(xiàn)，改善睡眠功效成分集中在30%洗脫物中，對(duì)其進(jìn)一步分離得到4個(gè)單體成分分別是朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、淫羊藿次苷，經(jīng)直接睡眠試驗(yàn)和自主活動(dòng)測(cè)試明確成分朝藿定C和淫羊藿苷均可提高小鼠入睡率、延長(zhǎng)睡眠時(shí)間及抑制自主活動(dòng)次數(shù)，說(shuō)明其具有改善睡眠的功效。

有關(guān)仙靈脾對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，大部分研究者[23-24]認(rèn)為淫羊藿苷起主要作用，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改善睡眠的功能成分主要為朝藿定C，而不是淫羊藿苷。該化合物在體內(nèi)可以通過(guò)增加中樞神經(jīng)的γ-氨基丁酸(GABA)含量或是抑制GABA轉(zhuǎn)氨酶的活性產(chǎn)生作用，具體是哪種作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。