李 濤 楊 瀟 孫桂芳 宋 陽 周興旺

(1.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410111；2.長沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

水產(chǎn)品中藥物殘留一直是社會(huì)的關(guān)注熱點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)中束狀帶分泌的一類甾體激素，屬于固醇類激素，能調(diào)節(jié)脂肪、蛋白質(zhì)等生物合成與代謝，具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗過敏、抗毒素等作用[1-2]，廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療。糖皮質(zhì)激素還可以提高蛋白轉(zhuǎn)換率，促進(jìn)動(dòng)物生長，一些飼養(yǎng)者在畜禽養(yǎng)殖過程中非法過量使用該藥物，導(dǎo)致水產(chǎn)品中藥物殘留[3]。為保障食品安全，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定，水產(chǎn)品中不得檢出糖皮質(zhì)激素類藥物殘留。

目前，糖皮質(zhì)激素類測定法主要有高效液相色譜法[4-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6-9]、微生物法[8]、毛細(xì)管色譜法[9]等。高效液相色譜法靈敏度低，選擇性差；微生物法方便快速，但易出現(xiàn)假陽性，且通量小，群選性差；毛細(xì)管色譜法雖提高了液相色譜法靈敏度，但仍存在靈敏度低，通量小等問題；液質(zhì)聯(lián)用法具有高靈敏度、高選擇性、高通量等特點(diǎn)，是藥物殘留分析最常用手段之一。四級(jí)桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜是依據(jù)靜電場軌道阱技術(shù)發(fā)展起來的新式質(zhì)譜[10]，具有高分辨率、高質(zhì)量精度、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，已應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析[11]、獸藥殘留分析[12-13]和食品非法添加[14]等領(lǐng)域。

試驗(yàn)擬利用四級(jí)桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，結(jié)合QuEChERS快速提取凈化技術(shù)，建立草魚中14種糖皮質(zhì)激素類藥物殘留的快速檢測方法，以期提供一種利用高分辨質(zhì)譜測定藥物殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮草魚：市售；

Hypersil Gold色譜柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國 Merck公司；

甲酸：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PSA萃取劑：40～63 μm，60A，德國CNW公司；

C18萃取劑：40～63 μm，德國CNW公司；

無水硫酸鎂：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氟米松(CAS 426-13-1，99.8%)、倍氯米松(CAS 4419-39-0，98.5%)、安西奈德(CAS 51022-69-6，99.5%)、氟米龍(CAS 426-13-1，97.9%)、醋酸氫化可的松(CAS 50-03-3，99.5%)標(biāo)準(zhǔn)品：北京曼哈格生物科技有限公司；

醋酸地塞米松(CAS 1177-87-3，100%)、布地奈德(CAS 51333-22-3，100%)、醋酸氟氫可的松(CAS50-03-3，99.7%)、醋酸潑尼松(CAS 125-10-0，100%)、倍他米松(CAS 378-44-9，100%)、氫化可的松(CAS 50-23-7，100%)、潑尼松(CAS 53-03-2，100%)、曲安奈德(CAS 76-25-5，100%)、地塞米松(CAS 50-02-2，100%)標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr公司。

1.2 儀器與設(shè)備

四級(jí)桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜：Q Exactive Focus型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

超高效液相色譜：Ultimate 3000型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

電子分析天平：BS224S型，德國賽多利斯公司；

冷凍離心機(jī)：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 液相色譜條件優(yōu)化

在相同洗脫程序和色譜柱條件下，選擇超純水、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—乙酸銨溶液(5 mmol/L)為無機(jī)流動(dòng)相，考察分離效果。色譜柱Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流動(dòng)相A為無機(jī)流動(dòng)相，流動(dòng)相B為乙腈；采用梯度洗脫模式(表1)進(jìn)樣；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在HESI離子源下，采用PRM/Targeted-MS2掃描，掃描范圍(m/z)50～550，分辨率35 000，毛細(xì)管電壓3 000 V；電噴霧離子源溫度320 ℃，氣化溫度350 ℃；鞘氣壓0.24 kPa；輔助氣壓0.091 kPa；離子傳輸管溫度320 ℃；噴霧電壓4.0 kV。取單一標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣，依據(jù)化合物分子量，在四極桿質(zhì)量分析器進(jìn)行Full MS掃描，依據(jù)化合物響應(yīng)值高低選擇化合物分析模式。

表1 梯度洗脫程序

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取劑優(yōu)化 取可食用部分混勻，精密稱取混勻后樣品2.0 g于50 mL離心管中，分別加入甲醇、乙腈、體積分?jǐn)?shù)1%甲酸—乙腈、體積分?jǐn)?shù)2%甲酸—乙腈25.0 mL，振蕩搖勻30 min，冷凍離心，取1.5 mL上清液加入50 mg PSA+100 mg無水硫酸鎂+100 mg C18萃取劑，振蕩混勻后高速離心，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定目標(biāo)物回收率。

1.5.2 凈化條件優(yōu)化 在相同提取條件下，1.5 mL上清液中加入PSA、C18和無水硫酸鎂凈化組合進(jìn)行凈化，凈化組合分別為A(100 mg C18+50 mg PSA+100 mg無水硫酸鎂)、B(100 mg C18+50 mg PSA)、C(50 mg C18+100 mg PSA+100 mg無水硫酸鎂)、D(75 mg C18+75 mg PSA+100 mg無水硫酸鎂)，振蕩混勻后高速離心，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定目標(biāo)物回收率。

1.6 線性范圍、檢出限和定量限測定

按1.5制備空白基質(zhì)溶液，以基質(zhì)溶液為稀釋液，配制2.0～100.0 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積的響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白草魚樣品添加低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品制備方式處理，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，以信噪比≥3的濃度為檢出限，信噪比≥10的濃度為定量限。

1.7 準(zhǔn)確度和精密度測定

在空白草魚樣品中加入糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后樣品濃度分別為20.0，40.0，200.0 μg/kg，每個(gè)濃度樣品制備6份，測定14種糖皮質(zhì)激素的含量，計(jì)算回收率和RSD值。

1.8 草魚樣品檢測

依據(jù)上述得出的最優(yōu)樣品制備方式處理草魚樣品，質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)采用保留時(shí)間進(jìn)行定性，結(jié)合離子豐度比和二級(jí)特征離子進(jìn)行確證，在最優(yōu)儀器條件下檢測草魚中14種糖皮質(zhì)激素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

經(jīng)掃描得知，14種糖皮質(zhì)激素化合物在正離子模式下響應(yīng)值最高，得到目標(biāo)物母離子信息。通過SIM掃描，設(shè)置低、中、高碰撞電壓，軌道阱檢測子離子信息，14種糖皮質(zhì)激素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 提取劑優(yōu)化

由圖1可知，體積分?jǐn)?shù)1%甲酸—乙腈提取效果最優(yōu)，14種糖皮質(zhì)激素綜合回收率較高，甲醇提取效果最差。乙腈具有沉淀蛋白作用，且溶液中微量甲酸可促進(jìn)糖皮質(zhì)激素化合物的電離，提高提取效率，而過量甲酸易與凈化劑發(fā)生反應(yīng)，降低回收率，影響提取效果。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

由圖2可知，100 mg C18、50 mg PSA和100 mg無水硫酸鎂組合時(shí)，基質(zhì)干擾小，14種糖皮質(zhì)激素類化合物回收率高。PSA吸附劑可有效去除提取液中脂肪酸、糖類、酚類及極性色素等成分，C18吸附劑去除脂肪和酯類等非極性干擾物，無水硫酸鎂能產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，降低提取液中親水成分的溶解度，經(jīng)高速離心后可去除。在固定體積的提取液中，吸附劑的量會(huì)影響目標(biāo)化合物的回收率，通常1.5 mL提取液單一吸附劑量為100 mg，無水硫酸鎂對(duì)糖皮質(zhì)激素?zé)o吸附作用，能提高目標(biāo)化合物的回收率，C18吸附劑對(duì)糖皮質(zhì)激素類化合物吸附較小而回收率較高。

2.4 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無機(jī)流動(dòng)相使用超純水分離峰形較差，響應(yīng)值較其他兩種流動(dòng)相差，無機(jī)流動(dòng)相選擇體積分?jǐn)?shù)0.1% 甲酸溶液和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—乙酸銨能有效分離14種糖皮質(zhì)激素，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液響應(yīng)值更高。正離子模式中，加入體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸可顯著提高目標(biāo)化合物電離效果，增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)，乙酸銨可增強(qiáng)部分化合物響應(yīng)值，但同時(shí)抑制某些化合物響應(yīng)值，為減少乙酸銨溶液對(duì)管路及質(zhì)譜的污染，采用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—乙腈流動(dòng)相體系。由圖3可知，14種化合物得到了有效分離。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限分析

由表3可知，14種糖皮質(zhì)激素在濃度為2.0～100.0 ng/mL 時(shí)，線性關(guān)系良好(R2≥0.999)，檢出限為1.3～6.0 μg/kg，定量限為4.5～20.0 μg/kg，利用基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液能有效降低基質(zhì)增強(qiáng)與抑制效應(yīng)，線性關(guān)系良好，能準(zhǔn)確檢測目標(biāo)化合物的含量。

表2 14種糖皮質(zhì)激素的離子選擇參數(shù)表?

? *定量離子。

圖1 不同提取劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

圖2 不同吸附劑組合對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

圖3 糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖

2.6 準(zhǔn)確度和精密度分析

由表4可知，加標(biāo)濃度為20.0 μg/kg時(shí)，回收率為76.9%～102.5%，RSD為2.3%～6.1%；加標(biāo)濃度為40.0 μg/kg 時(shí)，回收率為80.5%～103.3%，RSD為2.1%～6.2%；加標(biāo)濃度為200.0 μg/kg時(shí)，回收率為87.1%～97.3%，RSD為1.6%～6.3%。依據(jù)方法驗(yàn)證要求，回收率濃度通常設(shè)置在方法定量限、2倍定量限、10倍定量限附近，試驗(yàn)在低、中濃度回收率為60%～120%，高濃度回收率為80%～110%，RSD<10%，3個(gè)梯度加標(biāo)回收率和精密度良好。

表3 14種糖皮質(zhì)激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 14種糖皮質(zhì)激素的回收率和精密度

2.7 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用試驗(yàn)建立的檢驗(yàn)方法對(duì)市場采購的30批次鮮活草魚進(jìn)行檢測，均未檢出陽性樣品，表明草魚檢出糖皮質(zhì)激素風(fēng)險(xiǎn)較低，安全性較高。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了超高效液相色譜—四級(jí)桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中14種糖皮質(zhì)激素的方法，優(yōu)化了QuEChERS提取溶劑與吸附劑種類用量，并對(duì)線性方程、檢出限、定量限、回收率等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法簡單高效、靈敏度高，為批量快速檢測水產(chǎn)品中糖皮質(zhì)激素提供參考，也為建立水產(chǎn)品中糖皮質(zhì)激素類藥物殘留檢測方法提供數(shù)據(jù)支持。但試驗(yàn)方法所涉及的糖皮質(zhì)激素種類有限，今后應(yīng)不斷補(bǔ)充完善。