郭紅青 劉木華 袁海超 趙進輝 陶進江 陳 健 徐 寧

(1.江西農(nóng)業(yè)大學工學院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學生物光電及應用重點實驗室，江西 南昌 330045)

1974年，F(xiàn)leischmann等[5]從吸附在粗糙銀電極表面的吡啶上發(fā)現(xiàn)了表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)效應。SERS技術(shù)是基于被測樣品吸附在納米溶膠顆粒表面，使其SERS信號強度比普通拉曼信號強度增強104～106倍，與普通拉曼光譜相比，具有極強的拉曼散射增強效應[6-7]。張璐濤等[8]應用SERS光譜法實現(xiàn)了蜂蜜中的金霉素殘留檢測，實際樣本中金霉素加標回收率均為80%～120%。陳陽等[9]利用SERS光譜法結(jié)合化學計量學方法和支持向量回歸(SVR)實現(xiàn)了芘與菲溶液的定量分析。主成分分析法(Principle component analysis，PCA)是一種將可能有相關(guān)性的一些變量通過線性變換轉(zhuǎn)換為相對獨立的變量的方法，在保留原始數(shù)據(jù)有效信息的前提下，降低數(shù)據(jù)的維數(shù)，且變量的總方差維持不變[10-12]。線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)是通過降低不同物質(zhì)類別內(nèi)方差比例，擴大不同類別物質(zhì)間的差異，以實現(xiàn)較高的判別正確率，使用線性判別分析可以得到數(shù)據(jù)的最佳分類特征[13-14]。張芳等[15]采用紅外光譜結(jié)合化學計量學方法(PCA-LDA)實現(xiàn)對道地山藥和非道地山藥的有效判別，準確率分別為97.53%，98.88%。

試驗擬通過簡單的前處理方法對雞肉樣品中的AMOZ和AHD進行提取，然后利用SERS法結(jié)合PCA-LDA鑒別雞肉中AMOZ和AHD殘留類別(即無AMOZ和AHD殘留、AMOZ殘留、AHD殘留和AMOZ+AHD殘留共4類)，為動物源性食品中多抗生素殘留鑒別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞：江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場；

四氯金酸三水合物：金含量≥49.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

AHD標準品(純度約為99.3%)、AMOZ標準品(純度約為99.5%)：購于中國標準物質(zhì)網(wǎng)；

無水甲醇、乙腈、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等：分析純，南昌精科科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

高速組織攪碎機：DS-1型，上海標本模型廠；

便攜式拉曼光譜檢測系統(tǒng)：包括計算機，海洋光學有限公司提供的QE65000型拉曼光譜儀、785 nm激光器、光纖及樣品池等；

超聲波清洗器：JK-50B型，合肥金尼克機械有限公司；

萬用電磁爐：單聯(lián)型，北京科技永興儀器有限公司；

低速離心機：JW-1024型，安徽嘉文儀器裝備有限公司；

漩渦混合器：VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器有限公司；

石英進樣瓶：直徑11.5 mm，高30 mm，北京瑞盛博源科技發(fā)展有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 AMOZ或AHD標準儲備液的配制 稱取適量AMOZ或AHD標準品于容量瓶中，用超純水溶解并定容，配成100 mg/L的AMOZ或AHD標準儲備液，-4 ℃ 避光存放備用。

1.3.2 AMOZ+AHD混合標準儲備液的配制 稱取適量AMOZ和AHD標準品于容量瓶中，用超純水并溶解定容，配成AMOZ+AHD混合標準儲備液，-4 ℃避光存放備用。

1.3.3 雞肉標準儲備提取液的制備 取5.0 g攪碎的雞肉樣品，加入20 mL甲醇—水混合溶液(1∶1，體積比)，渦旋振動3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心10 min，棄上清液重復水洗1次，加入1 mol/L鹽酸0.5 mL 于殘留物中渦旋1 min加入AMOZ(或AHD、AMOZ+AHD)標準儲備液20 mL，并渦旋1 min或不進行此操作(雞肉空白提取液的制備)，加入乙腈10 mL和1 mol/L 氫氧化鈉0.5 mL，渦旋振動3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，殘留物再用10 mL乙腈重復提取1次，合并兩次上清液，取10 mL提取液60 ℃ 水浴氮吹至近干，用適量超純水定容，經(jīng)0.45 μm有機相濾膜過濾，備用。通過該制備流程可分別得到含AMOZ或AHD的雞肉標準儲備提取液、雞肉提取液混合加標儲備液和雞肉空白提取液。

1.3.4 不同濃度的AMOZ和AHD雞肉提取液的制備

用雞肉空白提取液將加標雞肉提取液儲備液稀釋成不同濃度的混合工作溶液。

1.3.5 納米Au溶膠的制備 根據(jù)文獻[16]修改如下：加熱0.01%氯金酸溶液(100 mL)至沸騰后，迅速加入 0.5%檸檬酸三鈉溶液1.0 mL，并用玻璃棒攪拌加熱10 min后，冷卻到室溫備用。

1.4 光譜測量

便攜式拉曼光譜檢測系統(tǒng)參數(shù)設置：根據(jù)文獻[17]略作修改。785 nm激光器選擇激光光源功率520 mW；拉曼光譜儀分辨率6 cm-1，平均信號強度0～60 000 au；采集光譜波段0～3 000 cm-1，平滑度1，積分時間10 s，積分2次，取平均值；選取拉曼光譜波段400～1 800 cm-1的光譜進行分析。

對雞肉提取液進行拉曼光譜采集，根據(jù)文獻[17]修改如下：將0.9 mL納米Au溶膠、50 μL待測雞肉提取液、100 μL NaCl溶液依次加入到2 mL石英進樣瓶中，混合均勻后，放入樣品池中采集其在吸附時間為0.5 min時的SERS光譜。

1.5 模型構(gòu)建

1.5.1 樣品預處理 先采用自適應迭代懲罰最小二乘法消除背景干擾，使用Matlab 2010軟件進行操作；再對拉曼光譜強度進行最大值標準歸一化預處理，將樣品數(shù)據(jù)標準歸一化，使用軟件The Unscrambler X 10.1進行操作。

1.5.2 PCA分析 采用PCA對預處理后的數(shù)據(jù)進行降維處理，提取特征變量，使用軟件The Unscrambler X 10.1進行操作。

1.5.3 LDA分析 使用The Unscrambler X 10.1軟件進行LDA分析?？倶颖緮?shù)280個，隨機選取3/4的樣本(210個樣本)作為校正集樣本[18]，建立判別模型；其余70個樣本作為預測集樣本，用分類正確率(即模型預測正確的樣本數(shù)與總樣本個數(shù)之比)來驗證判別模型的有效性。將含AHD的雞肉提取液樣品、含AMOZ的雞肉提取液樣品、含AHD+AMOZ的雞肉提取液樣品、雞肉空白提取液樣品依次標記為1～4，進行模型識別。其中，含AHD的雞肉提取液樣品中AHD濃度為0.5～25.0 mg/L，含AMOZ的雞肉提取液樣品中AMOZ濃度為0.2～25.0 mg/L，含AHD+AMOZ的雞肉提取液樣品中AHD和AMOZ濃度分別為1.0～25.0，0.5～25.0 mg/L，雞肉空白提取液樣品不含AHD和AMOZ。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉樣本的SERS光譜

由圖1可知，通過單峰無法直接將雞肉中殘留的AMOZ和AHD類別分辨出來。

2.2 雞肉中AHD和AMOZ殘留的主成分提取

通過試驗可知，前3個主成分對雞肉中AHD和AMOZ殘留的光譜數(shù)據(jù)的貢獻率分別為57.77%，37.62%，3.31%，累計貢獻率分別為57.77%，95.39%，98.70%；隨著主成分數(shù)目的增加，主成分的貢獻率越來越小，其中PC1貢獻率最大，為57.77%；當主成分數(shù)目為3時，累計貢獻率達98.70%，表明前3個主成分因子可代表原始數(shù)據(jù)信息中的大部分有效信息，在保證檢測有效性的基礎上，很大程度上消除了較多無用信息，提高了檢測分析效率[19-20]。因此，選擇前3個主成分繪制得分圖。

a.納米金膠 b.納米金膠+氯化鈉 c.雞肉提取液 d.含AMOZ的雞肉提取液 e.含AHD的雞肉提取液 f.含AMOZ+AHD的雞肉提取液

圖1 SERS光譜圖

Figure 1 The spectra of SERS

2.3 主成分得分

由圖2可知，雞肉提取液中只含AHD的樣品絕大部分都分布在X軸、Y軸的正半軸及Z軸負半軸部分；雞肉提取液中只含AMOZ的樣品都聚集在一起，基本都在YZ平面；雞肉空白提取液樣品產(chǎn)生團簇現(xiàn)象，基本集中在XZ平面與YZ平面的交界處；而雞肉提取液中含AHD和AMOZ兩種代謝物的樣品出現(xiàn)了分離現(xiàn)象，一部分與雞肉提取液中只含AHD的樣品重合，一部分與雞肉提取液中只含AMOZ的樣品重合，說明含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品的拉曼峰中不僅有只含AHD的雞肉提取液樣品的拉曼峰，還有只含AMOZ的雞肉提取液樣品的拉曼峰。從圖2可以看出，應用主成分分析方法可以有效地鑒別出雞肉提取液中是否含有AHD，是否含有AMOZ，但不能有效鑒別出含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品。

空心圓表示含AHD的雞肉提取液；五角星表示含AMOZ的雞肉提取液；三角形表示含AHD+AMOZ的雞肉提取液；加號表示雞肉空白提取液

圖2 主成分得分三維散點圖

Figure 2 3D scatter plot of PCA scores

2.4 模型及預測結(jié)果

由表1可知，在建立的模型中雞肉空白提取液樣本的校正集和預測集的判別正確率都達到了100%；只含AHD的雞肉提取液樣品的校正集的判別正確率為96.67%，預測集的判別正確率為100%；含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品的校正集的判別正確率為89.33%，預測集的判別正確率為96%；而只含AMOZ的雞肉提取液樣品的校正集的正確識別率較低，為63.33%，預測集的識別率為70%，可能是雞肉中只含AMOZ時的拉曼峰會與雞肉中同時含AHD和AMOZ時的拉曼峰有重合。

結(jié)合圖2和表1可知，雞肉中分別只含AHD和AMOZ的樣品的主成分得分散點圖均與雞肉中同時含AHD和AMOZ的樣品的得分散點圖有部分重合，當模型識別時，很可能會將只含AHD的和只含AMOZ的樣品被認為是雞肉中同時含AHD和AMOZ的樣品。但總體而言，模型校正集的判別正確率為90.48%，預測集的正確率為94.29%。故應用PCA-LDA建立的模型能有效識別雞肉提取液中是否含AHD和AMOZ，且可以鑒別出雞肉中AHD和AMOZ殘留的類別。

表1 主成分—線性判別模型的結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以納米Au溶膠和NaCl溶液為活性增強基底，應用SERS技術(shù)結(jié)合PCA-LDA對雞肉中AHD和AMOZ殘留進行識別分類。對雞肉中AHD和AMOZ殘留的4類樣品建立的模型中，校正集的判別正確率為63.33%～100.00%，總的判別正確率為90.48%；預測集的判別正確率為70.00%～100.00%，總的判別正確率達到了94.29%。試驗結(jié)果表明，與液相色譜、氣相色譜等傳統(tǒng)檢測方法相比，應用PCA-LDA能快速鑒別出雞肉中AHD和AMOZ殘留的類別，是雞肉中抗生素殘留快速檢測的發(fā)展趨勢。后期可采用非加標樣本來完善預測模型，進而為雞肉中的其他抗生素殘留快速檢測的實現(xiàn)提供重要理論依據(jù)。