林潔，高建，段永恒，段山，林圣

（深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心分子醫(yī)學(xué)實驗室 深圳518040）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡為30 ～55 歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢，其發(fā)病率仍居于女性癌癥發(fā)病前列[1,2]。宮頸癌從宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變或鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展而來，按組織結(jié)構(gòu)可劃分為鱗癌、腺癌和腺鱗癌3 種類型，通常都伴隨有人乳頭瘤病毒（HPV）的感染[3,4]。永生化的宮頸正常組織細胞系和宮頸癌細胞系是開展宮頸癌體外研究的重要材料，且不同的細胞系具有不同的HPV 亞型感染和差異化的細胞特性[5]。

通過轉(zhuǎn)染實現(xiàn)基因沉默或過表達是研究細胞內(nèi)基因功能的重要技術(shù)手段[6,7]。轉(zhuǎn)染是將外源性基因或基因的反義序列導(dǎo)入細胞內(nèi)，并在胞內(nèi)有效表達。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)按效果可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）；按轉(zhuǎn)染方式的不同又可分為電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法等[8]。其中脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法是常用的兩類轉(zhuǎn)染方式。本研究分別采用多種不同的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑比較它們在轉(zhuǎn)染常用宮頸（癌）細胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A 和Ect1/E6E7 中的效能，對于所有試劑轉(zhuǎn)染效果皆不佳的細胞系則測試電穿孔轉(zhuǎn)染的適用性，從而確定針對不同的宮頸（癌）細胞系最佳的轉(zhuǎn)染方式和轉(zhuǎn)染試劑，為相關(guān)研究提供參考方案。

材料與方法

1 研究采用的細胞系

宮頸細胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A、Ect1/E6E7 均購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。其中HeLa 細胞為HPV18 感染，SiHa 和CaSki 細胞為HPV16 感染，C33A 細胞無HPV 感染，而Ect1/E6E7 細胞為無HPV感染的永生化的正常宮頸上皮細胞。為保證研究的可靠性，我們采用STR 分型技術(shù)分別對實驗用的這五個細胞系進行鑒定，以避免細胞間的混淆污染。

2 主要試劑與儀器

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和Lipofectamine 3000 購自美國Life 公司，F(xiàn)uGENE HD 購自美國Roche 公司，jetPRIME 購自中國達科為生物技術(shù)有限公司。細胞培養(yǎng)所用的DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國HyClone 公司。pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒由實驗室構(gòu)建。

電轉(zhuǎn)化儀BEX CUY21 EDIT II 購自日本BEX公司，細胞計數(shù)儀Cellometer K2 購自中國達科為生物技術(shù)有限公司，倒置熒光顯微拍照系統(tǒng)購自德國Leica 公司，恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，其它細胞培養(yǎng)耗材購自美國Corning 公司。

3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染

在轉(zhuǎn)染實驗前一天，在24 孔板的每個孔的1ml培養(yǎng)基中加入1×106個細胞。每個條件設(shè)3 個平行重復(fù)。同時制備實驗所需的pcDNA3.1-EGFP 質(zhì)粒（以下簡稱EGFP 質(zhì)粒），按照NucleoSpin Plasmid 試劑盒步驟提取。

3.1 FuGENE HD 轉(zhuǎn)染方案

將FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑、EGFP 質(zhì)粒放置于室溫中，DMEM 復(fù)溫，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻。質(zhì)粒使用前快速渦旋幾秒，隨后瞬離。將100μl 無血清培養(yǎng)基加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg EGFP 質(zhì)粒，并充分混勻。再加入1.5μl FuGENE HD并猛烈彈EP 管混勻。室溫靜置15min。將凈置完畢的25μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中。輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

3.2 jetPRIME 轉(zhuǎn)染方案

將50μl jetPRIME buffer加入EP管中，再加0.5μg EGFP 質(zhì)粒。渦旋10s，瞬離。再加1μl jetPRIME reagent，渦旋10s，瞬離。室溫放置10min。將靜置完畢的50μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

3.3 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染方案

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、EGFP 質(zhì)粒和DMEM 放置于室溫中，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻。將50μl Opti-MEM?培養(yǎng)基加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg EGFP 質(zhì)粒，輕輕混勻。將50μl DMEM 加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入1.25μl Lipofectamine 2000，室溫孵育5min。孵育完畢后，將上述DNA 稀釋液和Lipofectamine 2000 稀釋液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min。將靜置完畢的100μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4～6h 后給細胞換液。

3.4 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染方案

將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、EGFP 質(zhì)粒和DMEM 放置于室溫中，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻或渦旋幾秒，隨后瞬離。將25μl DMEM 分別加入到兩個無菌1.5ml EP 管中，隨后各加入0.75μl Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑。將50μl DMEM 加入到另一無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg 待轉(zhuǎn)染EGFP 質(zhì)粒，再加入1μl P3000 Reagent。將稀釋好的DNA 加入到稀釋好的Lipofectamine 3000 中各25μl。室溫靜置5min。將靜置完畢的50μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4 電穿孔轉(zhuǎn)染

電轉(zhuǎn)之前細胞傳兩個或多個10cm 大皿。細胞長到90%時，離心收集細胞，350×g 離心4min，棄掉上清。加6ml 的OPTI-MEM 培養(yǎng)基充分重懸細胞，離心，棄上清。用1ml OPTI-MEM 重懸細胞，液體移到EP 管，進行細胞計數(shù)。同時重懸的細胞350×g 離4min，徹底去掉上清。用OPTI-MEM 重懸細胞（15μl OPTI-MEM/100 萬細胞）。取足量細胞液到另一EP 管，加質(zhì)粒（5μg 質(zhì)粒/100 萬細胞），充分混勻液體。用OPTI-MEM 潤洗電極杯，吸盡OPTI-MEM，緩慢加入18μl 混合液到電極杯，保證液體落到杯底部，并防止氣泡產(chǎn)生，以免影響轉(zhuǎn)化效率。將電極杯放入電極杯座上，測定電阻，通過添加OPTI-MEM調(diào)節(jié)電阻值在140Ω到200Ω之間后開始電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出電極杯，向其中添加150μL 的OPTI-MEM。用吸管充分混勻細胞，種到培養(yǎng)板中，加1.5ml 培養(yǎng)基，混勻?？瞻讓φ占?8μl細胞液，每組設(shè)3 個平行。然后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

5 轉(zhuǎn)染效率的檢測與比較

轉(zhuǎn)染24h 之后在倒置熒光顯微鏡下分別對每個孔的細胞在明場和熒光場下進行指定位置的拍照，以獲取直觀的轉(zhuǎn)染效率圖像。再用胰酶消化五株宮頸（癌）細胞系，10%小牛血清培養(yǎng)液終止消化，吹打，制成細胞懸液。500×g 離心5min。棄去上清，用PBS 重懸，500×g 離心5min。棄去上清，用適量PBS 重懸，最后使用Cellometer K2 細胞計數(shù)儀自動化測定攜帶熒光的細胞占總細胞數(shù)的比例。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有檢測結(jié)果均采用SPSS Statistics 22 軟件進行統(tǒng)計分析。每個樣本機器檢測3 次取均值作為觀測值。每個細胞的每種處理取3 個復(fù)孔的觀測值計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用方差分析對多組均數(shù)做顯著性檢驗，如差異有顯著性意義，則進一步采用LSD法做樣本均數(shù)之間的兩兩比較，確定哪兩個均數(shù)之間有顯著性差異，以評估各種轉(zhuǎn)染方案的優(yōu)劣。

結(jié) 果

1 STR 分型鑒定研究采用的宮頸（癌）細胞系

本實驗研究對象為廣泛應(yīng)用的5 種宮頸（癌）細胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A、Ect1/E6E7。它們有不同的形態(tài)特征、生長特性和HPV 感染狀態(tài)，對于全面探索宮頸癌變機理具有重大的價值[5]。然而有報道指出，目前世界范圍內(nèi)許多實驗室凍存的細胞株存在著嚴(yán)重的交叉污染問題，導(dǎo)致研究結(jié)果與實際有較大偏差[9,10]。鑒于此，我們對于此前購買并凍存和培養(yǎng)的以上5 個細胞系，采用STR 分型技術(shù)進行了鑒定，鑒定結(jié)果如表1 所示，5 個細胞系均與ATCC 等原始出處給予的鑒證信息相匹配，表明細胞系純粹無污染，可準(zhǔn)確應(yīng)用于相應(yīng)的研究。

2 四種常用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染五個宮頸（癌）細胞系的效果比較

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是實驗研究中最常用也是最便捷的傳遞核酸進細胞的方式[11]。我們檢測了4 種常用的以脂質(zhì)體介導(dǎo)為原理的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑：FuGENE HD、jetPRIME、Lipofectamine 2000（以下簡稱Lipo 2000）和Lipofectamine 3000（以下簡稱Lipo3000），在分別轉(zhuǎn)染上述5 個常見的宮頸（癌）細胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A 和Ect1/E6E7 時的效率。在各轉(zhuǎn)染試劑用戶指南推薦的操作流程和推薦的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑濃度配比下，實驗達到的轉(zhuǎn)染效率有顯著差異。在倒置熒光顯微鏡下同一視野的影像（圖1）顯示，明場展示所有存活的貼壁細胞，熒光場展示轉(zhuǎn)染EGFP 質(zhì)粒成功在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光的細胞。為了進一步定量地比較轉(zhuǎn)染效率的差異，我們將細胞消化后在自動化細胞計數(shù)儀的輔助下測定熒光細胞比例（圖2）?？梢钥吹?，在HeLa 細胞中，jetPRIME 的轉(zhuǎn)染效率最高達到66.3%，而Lipo 3000也達到較高的效率為37.4%。HeLa 是宮頸癌研究最為廣泛應(yīng)用的細胞系，大多數(shù)化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑在開發(fā)時都以此細胞系作為測試和優(yōu)化，因此都能達到比較高的轉(zhuǎn)染效率。四種轉(zhuǎn)染試劑在SiHa 細胞系中的轉(zhuǎn)染效率相接近，均在10%～15%左右。在C33A細胞系Lipo3000 和jetPRIME 中分別取得16.0%和11.9%的轉(zhuǎn)染率，而FuGENE HD 和Lipo 2000 的轉(zhuǎn)染率都很低下。對于CaSki 細胞系和Ect1/E6E7（簡稱為E6E7）細胞系，4 種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率都很低，不能夠滿足基因功能研究的需求。

表1 各細胞系STR 分型鑒定結(jié)果Tab. 1 The STR genotyping verification results of each cell line

3 電穿孔法提升化學(xué)轉(zhuǎn)染法難轉(zhuǎn)細胞系的轉(zhuǎn)染效率

對于化學(xué)難轉(zhuǎn)的CaSki 細胞系和Ect1/E6E7 細胞系，我們嘗試采用電穿孔轉(zhuǎn)染的方式提高其基因轉(zhuǎn)染效率。BEXCUY21 EDIT II 具有一套組合脈沖系統(tǒng)：高壓“穿孔脈沖”和低壓“驅(qū)動脈沖”。極短的高壓穿孔脈沖在細胞表面形成很多小孔，隨后低壓驅(qū)動脈沖可引導(dǎo)DNA 或藥物進入細胞，通過調(diào)整脈沖時間和脈沖間隔可得到極佳的轉(zhuǎn)染效率和細胞生存率。電穿孔轉(zhuǎn)染最重要的影響條件為其穿孔電壓，因而我們測試了在梯度電壓下其轉(zhuǎn)染效率的變化。在相同的7ms 脈沖波長、10ms 脈沖間隙和20V 驅(qū)動電壓下，不同穿孔電壓得到的CaSki 細胞系和Ect1/E6E7 細胞系轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)一定的波動，在170V 處轉(zhuǎn)染效率達到最高，且均高于化學(xué)轉(zhuǎn)染法（圖3）。

討 論

通過比較選擇和優(yōu)化轉(zhuǎn)染方案是開展眾多細胞學(xué)和動物學(xué)研究的前提條件[12,13]。本實驗按照四種轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑用量，針對5株宮頸癌細胞，比較4 種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染GFP 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。細胞的生長狀態(tài)也是影響轉(zhuǎn)染效率的一個重要因素，本研究選擇對數(shù)生長期的細胞進行試驗，保證細胞在最佳狀態(tài)下進行轉(zhuǎn)染。研究表明同一種轉(zhuǎn)染試劑進行不同細胞株的轉(zhuǎn)染，得到的轉(zhuǎn)染效率不同[14]。例如jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑在Hela 細胞中的轉(zhuǎn)染效率達到66%，而在CaSki 細胞中低到0.3%。這可能與細胞膜的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。同樣的，實驗表明，4 種轉(zhuǎn)染試劑在同一株細胞中的轉(zhuǎn)染效率不同。例如，在Hela 細胞中jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率達到66%，而Lipofectamine 2000 只有7.4%。也有其他研究者證明不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染同一株細胞得到的轉(zhuǎn)染效率不同，這可能與轉(zhuǎn)染復(fù)合物進入細胞內(nèi)的方式有關(guān)[15-18]。再者，多個實驗證實Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑對細胞有一定的毒性[15,16,19-22]，在本實驗中不僅轉(zhuǎn)染效果差，在轉(zhuǎn)染4h 之后還要換液，操作麻煩且易造成換液過程中細胞的損失，因此不推薦使用[23]。

圖1 倒置熒光顯微鏡下4 種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率比較。比例尺，100μmFig. 1 Comparison for transfection efficiency of 4 transfection reagents under the inverted fluorescence microscope. Scale bar, 100μm

FuGENE HD、jetPRIME、Lipofectamine 2000 和Lipofectamine 3000 這4 種轉(zhuǎn)染試劑對Ect1/E6E7、CaSki 細胞的轉(zhuǎn)染效果都很差，轉(zhuǎn)染效率均低于10%。因此我們考慮用電穿孔轉(zhuǎn)染法探索最佳轉(zhuǎn)染條件。實驗首先對電轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染參數(shù)進行了系統(tǒng)的摸索和優(yōu)化，最后在相同的脈沖波長7ms、脈沖間隙10ms 和驅(qū)動電壓20V 的條件下，設(shè)計穿孔電壓梯度，探索最佳穿孔電壓。Cellometer K2 定量檢測結(jié)果表明，針對難轉(zhuǎn)細胞系Ect1/E6E7、CaSki，在穿孔電壓為170V 時，電穿孔轉(zhuǎn)染法可以得到高出化學(xué)轉(zhuǎn)染法三、四倍的轉(zhuǎn)染效率，改善了難轉(zhuǎn)細胞轉(zhuǎn)染效率很低的情況。但電轉(zhuǎn)染給細胞造成很大的損傷，細胞存活率不高，細胞恢復(fù)正常的生長狀態(tài)慢[20,24-27]。因此，電穿孔轉(zhuǎn)染法更適用于難轉(zhuǎn)細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[28]。

圖2 4 種轉(zhuǎn)染試劑在各細胞系中轉(zhuǎn)染效率比較。*，與轉(zhuǎn)染效率最高的試劑比較, P＜0.001Fig. 2 Comparison for transfection efficiency of 4 transfection reagents in each cell line. *, P＜0.001 compared with the highest transfection efficiency group

圖3 CaSki 和Ect1/E6E7 細胞系在不同穿孔電壓下電轉(zhuǎn)效率比較。與轉(zhuǎn)染效率最高的電壓比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001Fig. 3 Comparison for electransfection efficiency in CaSki and Ect1/E6E7 cells under series of poration pulse voltage. Compared with the voltage with the highest transfection efficiency∶ *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; ***, P＜0.001

在后續(xù)針對宮頸細胞系開展的研究中，根據(jù)以上實驗結(jié)果有目的性地選擇合適的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔轉(zhuǎn)染方案，將能顯著地提升實驗效果，簡化條件摸索的過程。