梁其干，熊顯鵬，李艷軍，張新宇，孫 杰

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

棉花作為全球性的主要經(jīng)濟(jì)作物，在社會(huì)發(fā)展的多個(gè)產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要作用，如棉纖維可作為紡織工業(yè)原料，棉籽油可作為食用油等。陸地棉是目前世界上栽培面積最廣的棉花，其產(chǎn)量占世界棉花總產(chǎn)量的90%以上[1]。然而，陸地棉在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常常受到病蟲(chóng)害的威脅，尤其是黃萎病，是對(duì)陸地棉產(chǎn)量和品質(zhì)影響最大的病害之一。據(jù)估計(jì)，中國(guó)每年黃萎病的發(fā)生面積占全國(guó)植棉面積的一半，對(duì)農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，選育和種植抗黃萎病的棉花品種被認(rèn)為是防治黃萎病的有效措施，抵抗黃萎病菌侵染已成為選育棉花新品種的重要目標(biāo)性狀[3]。由于陸地棉中缺乏抗黃萎病的資源，利用傳統(tǒng)的育種手段難以選育出具有抗黃萎病性狀的棉花品種[4]?；蚬こ碳夹g(shù)為培育抗黃萎病新種質(zhì)材料和培育抗病品種帶來(lái)了希望，了解棉花抗黃萎病的分子機(jī)制以及挖掘棉花抗黃萎病相關(guān)基因是當(dāng)前的主要任務(wù)[5]。

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethioninedecarboxylase, SAMDC)是植物體多胺生物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它通過(guò)催化S-腺苷甲硫氨酸形成脫羧的SAM，提供氨丙基供體參與精胺和亞精胺的合成，維護(hù)植物體內(nèi)多胺的動(dòng)態(tài)平衡[6-7]。在GenBank中記錄的SAMDC基因約有2 400個(gè)，其中植物中約有300個(gè)。原核生物和真核生物中的SAMDC蛋白沒(méi)有序列相似性，而植物中的SAMDC具有較高的序列相似性[8]。目前已從番茄[9]、甘蔗[10]、油菜[11]、小麥[12]等多種植物中分離到SAMDC基因，發(fā)現(xiàn)SAMDC參與高鹽、水分、低溫等多種非生物脅迫和生物脅迫反應(yīng)[13-15]。近期的研究發(fā)現(xiàn)將海島棉SAMDC轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥的黃萎病抗性得到提高，轉(zhuǎn)基因植株中真菌DNA生物量顯著降低，該研究表明SAMDC基因在抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16]。陸地棉中僅克隆了4個(gè)SAMDC基因，研究主要集中于其在非生物脅迫中的表達(dá)模式及功能分析方面[17]，SAMDC基因家族在陸地棉中究竟包含多少成員，是否都與棉花黃萎病抗性相關(guān)仍有待進(jìn)一步研究。

陸地棉遺傳的標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的全基因組測(cè)序?yàn)镚hSAMDC家族基因的鑒定提供了便利條件[18]。本研究以已報(bào)道的棉花SAMDC蛋白為探針序列，鑒定到14個(gè)GhSAMDC家族基因，對(duì)基因的序列以及染色體定位等情況進(jìn)行分析，并對(duì)黃萎病菌脅迫下基因在不同抗感品種中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為今后克隆及研究GhSAMDC基因在棉花抵抗黃萎病菌侵染過(guò)程中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

2個(gè)陸地棉品種‘中植棉2號(hào)’(耐黃萎病)和‘新陸早7號(hào)’(感黃萎病)均由石河子大學(xué)棉花研究所提供，大麗輪枝菌強(qiáng)致病菌系由石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.1 棉苗培養(yǎng) 將‘新陸早7號(hào)’和‘中植棉2號(hào)’棉種在溫水中浸泡8～12 h后，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，挑選發(fā)芽整齊一致的種子均勻種于水盒中，每盒種植的種子數(shù)量相同，置于人工氣候室中培養(yǎng)，光照度6 000～7 000 lx，每天光照時(shí)間12 h，晝溫27～28 ℃，夜溫20～22 ℃，濕度40%～50%。待植株長(zhǎng)出2片真葉時(shí),將幼苗取出用于黃萎病菌脅迫處理。

1.1.2 大麗輪枝菌孢子液的制備 將4 ℃冷藏保存的大麗輪枝菌轉(zhuǎn)移至PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃活化15 d后，接種至Czapeak’s液體培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗振蕩(120 r/min)培養(yǎng)10 d。菌液用滅菌的紗布過(guò)濾后制成孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液至1.0×107個(gè)/mL。

1.1.3 棉苗處理與取樣 采用蘸根法侵染棉花幼苗，具體操作如下：選取大小均勻一致，生長(zhǎng)健壯的棉苗浸泡于大麗輪枝菌孢子懸浮液中，浸泡2 min后放入水中。黃萎病菌侵染0、12、24和48 h后收取棉花幼苗的根系，各時(shí)間點(diǎn)收取10株，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

1.2 方 法

1.2.1GhSAMDC家族基因獲取的鑒定 通過(guò)以已報(bào)道的棉花SAMDC蛋白(GenBank: JN020148)為探針序列，從Gossypiumhirsutum基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.cottongen.org)中利用BlastP序列比對(duì)搜索鑒定出所有GhSAMDC家族基因。用SMART(http://www.conttongen.org)和PFAM(http://pfam.sanger.ac.uk/)軟件對(duì)候選基因的酶原剪切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確認(rèn)，去除非全長(zhǎng)的短片段及冗余序列，獲得GhSAMDC家族基因序列。從Gossypiumhirsutum基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GhSAMDC家族基因的cDNA序列，利用NCBI BLASTX分析基因的開(kāi)放閱讀框，利用ExPAsy(http://web.expasy.org/)在線工具分析基因的編碼蛋白的殘基數(shù)(aa)、分子質(zhì)量(MW)和等電點(diǎn)(pI)。

1.2.2GhSAMDC家族基因的克隆 采用CTAB/酸酚法提取棉花根系中的總RNA[19]。用DNase I(Deoxyribonuclease I)處理后，采用NanoDrop 1000核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度值和OD260/OD280的比值，對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢驗(yàn)，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。用Reverse Transcriptase M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物)獲得cDNA第1鏈，保存在-80 ℃冰箱中用于后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)GhSAMDC基因家族的電子序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的引物(表1)，利用RT-PCR技術(shù)從陸地棉根組織cDNA中擴(kuò)增GhSAMDC家族基因。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL、dNTPs 0.8 μL、上游引物(10 μmol/L)0.25 μL、下游引物(10 μmol/L)0.25 μL、10×TaqBuffer 1 μL、EX-Taq DNA聚合酶0.2 μL，補(bǔ)ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52～56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3GhSAMDC家族基因多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 利用DNAman軟件將鑒定獲得的所有SAMDC蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，其中設(shè)定選擇強(qiáng)調(diào)的同源性水平≥50%，并且對(duì)其他的參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)，在獲得的結(jié)果中查找GhSAMDC家族基因的保守功能域。使用數(shù)據(jù)處理軟件MEGA 4.0采取Neighbor-Joining(鄰近相連算法)的方法構(gòu)建SAMDC蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中設(shè)定校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap為1 000。

1.2.4GhSAMDC家族基因的染色體分布 從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取陸地棉A和D染色體組中各染色體的長(zhǎng)度信息，同時(shí)獲取GhSAMDC基因家族在染色體上的定位信息，用Map Inspect軟件繪制出GhSAMDC基因家族的染色體物理分布圖。

1.2.5 大麗輪枝菌侵染后GhSAMDC家族基因在棉花根系中的表達(dá)模式分析 在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，以大麗輪枝菌侵染0、12、24和48 h的‘中植棉2號(hào)’和‘新陸早7號(hào)’的根系為材料，用植物總RNA提取試劑盒(RNA Prep Pure Plant Kit，天根生化科技有限公司，北京，中國(guó))提取根系中的總RNA，質(zhì)量檢測(cè)合格的RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司，采用Illumina 4000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本試驗(yàn)中根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，獲取GhSAMDC家族各基因的表達(dá)量RPKM(Reads per kb per million)值，采用Heml軟件對(duì)14個(gè)GhSAMDC基因的表達(dá)數(shù)據(jù)繪制熱圖。

隨機(jī)選取5個(gè)GhSAMDC基因，根據(jù)它們的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以陸地棉His 3為內(nèi)參基因，以‘新陸早7號(hào)’和‘中植棉2號(hào)’大麗輪枝菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的棉花幼苗的根系cDNA為模板，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GhSAMDC基因家族的表達(dá)模式進(jìn)行分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 1 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，SYBRPrimix ExTaqTM(2×)5 μL補(bǔ)ddH2O至10 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，55～57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次，每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Excel Version進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

表1 陸地棉GhSAMDC家族基因的引物Table 1 Primers of GhSAMDC family genes in Gossypium hirsutum

2 結(jié)果與分析

2.1 GhSAMDC家族基因的鑒定及克隆

以棉花GhSAMDC基因?yàn)樘结樞蛄校诋愒此谋扼w陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出14條序列，分別命名為GhSAMDC1至GhSAMDC14(表2)。該家族基因成員的開(kāi)放閱讀框(ORF)核苷酸序列長(zhǎng)度為1 029～1 176 bp，其對(duì)應(yīng)的編碼氨基酸序列長(zhǎng)度為337～391 aa。通過(guò)對(duì)14個(gè)GhSAMDC蛋白做進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贏基因組和D基因組上存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，分為7對(duì)(圖1)。每對(duì)中的2個(gè)成員均具有較高的序列相似性，難以進(jìn)行區(qū)分，因此將它們視為基因的2個(gè)拷貝。設(shè)計(jì)擴(kuò)增7個(gè)GhSAMDC基因ORF(open reading frame，開(kāi)放閱讀框)的引物(表1)，以陸地棉根系cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，7個(gè)基因分別為GhSAMDC1、GhSAMDC4、GhSAMDC6、GhSAMDC7、GhSAMDC9、GhSAMDC10和GhSAMDC14，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增條帶的大小與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)它們的序列與電子序列一致。

2.2 GhSAMDC家族基因多重序列比對(duì)

利用ClustalX和DNAman軟件對(duì)7個(gè)SAMDC蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，7對(duì)基因中每對(duì)選取1個(gè)成員。對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)蛋白序列的一致性為51.25%，序列中含有2個(gè)SAMDC蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，即酶原剪切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域外的序列具有較大差異(圖3)。

表2 陸地棉GhSAMDC家族基因的基本信息Table 2 Basic information of GhSAMDC gene family in Gossypium hirsutum

圖1 陸地棉GhSAMDC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of GhSAMDC proteins of Gossypium hirsutum

M.Mark 3；1：GhSAMDC1；2.GhSAMDC3;3.GhSAMDC5；4.GhSAMDC7；5.GhSAMDC10；6.GhSAMDC11；7.GhSAMDC13

圖2GhSAMDC家族基因cDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖
Fig.2PCRamplificationofGhSAMDCgenefamilycDNA

2.3 GhSAMDC基因染色體定位分析

14個(gè)陸地棉GhSAMDC基因在A和D亞基因組上呈現(xiàn)均勻分布，有7個(gè)成員在A亞組上，7個(gè)成員位于D亞組,無(wú)家族成員構(gòu)成基因簇的現(xiàn)象(圖4)。在A05、D05、A08、D08、A09、D09、A10、D10、A13和D13上分別含有1個(gè)GhSAMDC基因，這5對(duì)GhSAMDC基因在A、D亞組上一一對(duì)應(yīng)，為平行進(jìn)化的同源基因。在D02染色體上分布2個(gè)GhSAMDC基因，其中GhSAMDC2對(duì)應(yīng)于A02染色體上的GhSAMDC1基因，GhSAMDC4在A02染色體上無(wú)相對(duì)應(yīng)的平行進(jìn)化的同源基因,對(duì)應(yīng)于A03染色體上的GhSAMDC3基因。

灰色和黑色區(qū)域分別代表 75%以上和 100%的保守區(qū) Grey and black regions represent the conversation region of over 75% and 100%, respectively

圖3陸地棉GhSAMDC蛋白氨基酸多重序列比對(duì)
Fig.3MultipleaminoacidsequencealignmentofGhSAMDCproteinsinGossypiumhirsutum

圖4 陸地棉染色體上 GhSAMDC 基因的分布Fig.4 Distribution of GhSAMDC gene on chromosome of Gossypium hirsutum

2.4 黃萎病菌侵染后GhSAMDC基因家族的表達(dá)模式分析

由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可見(jiàn)(圖5)，GhSAMDC家族基因在2種陸地棉根組織中均有表達(dá)。14個(gè)基因中，GhSAMDC4、GhSAMDC5、GhSAMDC6、GhSAMDC10、GhSAMDC12、GhSAMDC13和GhSAMDC14在感病棉花根系中的表達(dá)模式與抗病品種存在一定程度的相似性，其他基因在2個(gè)品種中的表達(dá)模式不同。GhSAMDC3、GhSAMDC9和GhSAMDC11在不同抗感品種中受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量均有明顯變化，其高峰值在不同抗感品種中出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不同。GhSAMDC7和GhSAMDC8在抗病品種中受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量在12 h明顯升高，然后下降；在感病品種中其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。GhSAMDC1在抗病品種中表達(dá)量持續(xù)升高；在感病品種中其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。由于GhSAMDC7、GhSAMDC8和GhSAMDC1在抗病品種中對(duì)黃萎病菌的侵染均有明顯的響應(yīng)，但在感病品種中未見(jiàn)明顯的響應(yīng)，暗示這3個(gè)基因可能參與棉花抵抗黃萎病菌的過(guò)程。另外，7對(duì)基因中的2個(gè)成員序列相似度較高，但表達(dá)模式不完全相同，GhSAMDC3/4、GhSAMDC7/8和GhSAMDC11/12在抗病品種中具有相似的表達(dá)模式，GhSAMDC5/6在抗感品種中均具有相似的表達(dá)模式，其他基因的表達(dá)模式均不同。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，隨機(jī)選取GhSAMDC3、GhSAMDC7、GhSAMDC10和GhSAMDC134個(gè)基因設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)其在抗病品種中的表達(dá)模式進(jìn)行qPCR分析(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本符合，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠準(zhǔn)確反應(yīng)基因的表達(dá)模式。

圖5 差異表達(dá)基因的表達(dá)譜熱圖Fig.5 Expression profile heat of deferentially expressed genes

3 討論與結(jié)論

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)在多胺合成中具有關(guān)鍵的作用，在植物受到生物以及非生物脅迫時(shí)作出響應(yīng)。目前，對(duì)SAMDC基因進(jìn)行全基因組水平上的生物學(xué)信息分析仍未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)陸地棉GhSAMDC家族基因的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉GhSAMDC家族基因有14個(gè)成員，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)該基因家族具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，并可分為7對(duì)GhSAMDC基因。陸地棉屬于AADD型基因組，在A、D亞組的基因具有很高的共線性特征[8-9]，本研究中鑒定到的14個(gè)陸地棉GhSAMDC基因在A亞組和D亞組中的分布就很好地體現(xiàn)了這一特性，14個(gè)GhSAMDC基因均勻地分布在A、D亞組，并存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用在GenBank中已報(bào)道的SAMDC基因編碼序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物,選取十字花科植物，利用分子生物技術(shù)(PCR)得到SAMDC基因的同源序列，通過(guò)序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)序列的同源性能達(dá)87%以上,所得氨基酸序列相似性可達(dá)90%以上[21-22]。而本研究中陸地棉GhSAMDC基因的14家族基因的氨基酸序列同源相似性僅為50%左右，這說(shuō)明各基因家族成員除了顯著一致的保守功能域之外的基因序列也有較大的差異。這為進(jìn)一步深入研究棉花中GhSAMDC基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

圖6 GhSAMDC基因家族在‘中植棉2號(hào)’中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of GhSAMDC gene family in cotton ‘Zhongzhimian 2’

多胺在植物逆境脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中起重要作用[23]。S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(SAMDC)是多胺合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，有助于植物維護(hù)體內(nèi)多胺動(dòng)態(tài)平衡[24]。因此，植物GhSAMDC基因主要是通過(guò)調(diào)控植物體內(nèi)多胺含量影響植物應(yīng)答環(huán)境脅迫，SAMDC基因在植物幼嫩或分裂活躍組織中表達(dá)水平較高,在老化或分裂能力較弱的組織中表達(dá)較低[25-26]。在棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，SAMDC在不同組織中的表達(dá)水平也有差異[17]。擬南芥中過(guò)表達(dá)SAMDC基因可以增強(qiáng)植株清除活性氧自由基的能力,從而提高植株在干旱脅迫條件下的抗性[27]。而沉默煙草中的SAMDC基因在鹽脅迫條件下植物生長(zhǎng)活力減弱, 抗氧化能力以及光合能力下降[28]。前人研究大多數(shù)是從環(huán)境脅迫方面，如低溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫等來(lái)研究GhSAMDC基因?qū)δ婢趁{迫應(yīng)答的作用。本研究則是從生物脅迫方面，對(duì)該基因家族在黃萎病菌脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究GhSAMDC基因在棉花抗黃萎病過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。本研究采用RT-PCR克隆技術(shù)從陸地棉根組織cDNA中克隆得到GhSAMDC基因家族, 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了該家族基因在黃萎病菌脅迫后的表達(dá)模式，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量分析了部分基因在抗病棉花品種中黃萎病菌脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhSAMDC1、GhSAMDC7和GhSAMDC8基因在抗病品種中對(duì)黃萎病菌的脅迫響應(yīng)更強(qiáng)烈，推測(cè)這3個(gè)基因在棉花抵御黃萎病菌脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但GhSAMDC基因家族的功能和抵御黃萎病菌脅迫的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。