吳偉鑫 ， 蓋新娜 ， 周 磊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193)

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

有規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)廣泛存在于絕大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的crRNA(CRISPR-RNA)與反式激活的tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)共同構(gòu)成引導(dǎo)RNA(guide RNA, gRNA)，gRNA可引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas蛋白(CRISPR associated protein)對(duì)噬菌體的基因片段進(jìn)行切割，構(gòu)成細(xì)菌的CRISPR-Cas免疫防御系統(tǒng)。人們發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)人工合成的gRNA模擬自然的tracrRNA和crRNA結(jié)構(gòu)，與Cas蛋白一起特異性識(shí)別和剪切核酸序列，構(gòu)成新一代的基因編輯技術(shù)。2013年，2個(gè)團(tuán)隊(duì)[1-2]首次使用嗜熱鏈球菌和化膿性鏈球菌構(gòu)建Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，隨后該系統(tǒng)日趨成熟，并被廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組編輯。 2015年，該家族內(nèi)的另一系統(tǒng)CRISPR-CasC2c2[3](現(xiàn)稱Cas13)被成功鑒定，與Cas9不同， Cas13結(jié)合和切割的對(duì)象為RNA。目前科學(xué)家們已經(jīng)從Leptotrichiabuccalis(Lbu)、Leptotrichiawadei(Lwa)、Leptotrichiashahii(Lsh)以及Lachnospiraceaebacterium(Lba)等多種細(xì)菌中解析出了Cas13a結(jié)構(gòu)，根據(jù)其來(lái)源不同分別稱為L(zhǎng)buCas13a[4]、LwaCas13a[5]、LshCas13a[6]和LbaCas13a[7]。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類

目前CRISPR-Cas系統(tǒng)分為2類、6型和30多種亞型[8]。其中1類系統(tǒng)(包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型)具有多個(gè)亞單位效應(yīng)復(fù)合物，包括多個(gè)Cas蛋白；而2類系統(tǒng)(包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)中效應(yīng)物是種類單一、體積較大、多結(jié)構(gòu)域的蛋白分子[9](見(jiàn)中插彩版圖1)。研究表明，所有的CRISPR-Cas系統(tǒng)可能來(lái)源于同一個(gè)祖先，1類系統(tǒng)在進(jìn)化過(guò)程中變?yōu)榫哂袉我还δ艿腃as基因，同時(shí)丟失其他的Cas基因從而形成2類系統(tǒng)[10]。CRISPR-Cas13系統(tǒng)屬于2類CRISPR系統(tǒng)的Ⅵ型，根據(jù)結(jié)構(gòu)還可再細(xì)分為a、b、c、d四個(gè)亞型。

圖1 兩類CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)差異及主要組成[9]

3 CRISPR-Cas13系統(tǒng)的作用機(jī)理

以CRISPR-Cas13a系統(tǒng)為例，高分辨率結(jié)構(gòu)分析[4]顯示細(xì)菌Leptotrichiabuccalis(Lbu)中解析出的LbuCas13a屬于“雙瓣葉”球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由1個(gè)crRNA識(shí)別瓣葉(Recognition lobe, REC)和1個(gè)核酸酶瓣葉(Nuclease lobe, NUC)組成，其NUC上有2個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合域(Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)。

圖2 LbuCas13a、crRNA、靶RNA復(fù)合物的復(fù)合結(jié)構(gòu)[4]

Cas13a效應(yīng)蛋白在識(shí)別靶RNA上的前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)(在Cas13a中稱為Protospacer flanking site,PFS)并與其結(jié)合的過(guò)程中可發(fā)生構(gòu)象變化，HEPN1結(jié)構(gòu)域在靶RNA結(jié)合后向HEPN2方向移動(dòng)，形成一個(gè)活化的HEPN催化位點(diǎn)。活化的HEPN催化位點(diǎn)表現(xiàn)出兩種核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性，一種可將自身的pre-crRNA處理為crRNA，令一種表現(xiàn)為HEPN-RNase活性，對(duì)靶RNA或游離RNA進(jìn)行切割[4]。

圖3 Cas13a構(gòu)象改變和HEPN活化以及表現(xiàn)RNase活性的過(guò)程[4]

Cas13a的催化位點(diǎn)位于外表面，所以一旦Cas13a被靶標(biāo)RNA結(jié)合激活，就可以發(fā)揮非特異性RNA酶功能，裂解任何可觸及的單鏈RNA(single-stranded RNA, ssRNA)，而不論它們是否與crRNA同源或是否存在PFS，這種效應(yīng)稱為附帶切割效應(yīng)(Collateral effect)。相比之下，Cas9和Cas12只能在其HNH或RuvC兩個(gè)核酸酶催化位點(diǎn)的引導(dǎo)鏈(gRNA)上切割靶標(biāo)雙鏈DNA(double-stranded DNA, dsDNA)[4]。Cas13b同樣包含2個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域，因此有類似Cas13a的功能，Cas13d在大多數(shù)方面表現(xiàn)與先前研究的Cas13類似，而Cas13c相關(guān)研究較少[11]。

4 CRISPR-Cas13技術(shù)的應(yīng)用

自2015年C2c2(現(xiàn)稱Cas13)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其研究突飛猛進(jìn)，并于2017年被《Nature Methods》評(píng)為2016年度革新技術(shù)[12]。該靶向RNA的核酸編輯技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域均有所應(yīng)用。

4.1 RNA示蹤 Cas13a蛋白的HEPN 結(jié)構(gòu)域中Arg(精氨酸)和His(組氨酸)突變可形成核酸酶活性缺失的dCas13a(dead Cas13a)，其能夠結(jié)合目標(biāo)RNA但不切割，因此成為一個(gè)可編程的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)，利用其與特定RNA序列的結(jié)合特性，配合熒光標(biāo)記技術(shù)可對(duì)胞內(nèi)特定RNA片段進(jìn)行示蹤[13]。

4.2 臨床診斷 通過(guò)設(shè)計(jì)與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的gRNA，并與Cas13蛋白組裝可組成RNA檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)。其報(bào)告基因通常一端為熒光基團(tuán)，另一端是化學(xué)猝滅劑，當(dāng)報(bào)告基因與樣品中的特異性靶標(biāo)核酸結(jié)合時(shí)，Cas酶將對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行裂解，從猝滅劑中釋放熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，且信號(hào)可量化。利用該技術(shù)可對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行精確測(cè)量或定性分析[14]。

圖4 應(yīng)用報(bào)告基因reporter進(jìn)行核酸檢測(cè)[14]

利用Cas13在靶識(shí)別時(shí)表現(xiàn)出的附帶切割效應(yīng)，Gootenberg[15]等通過(guò)設(shè)計(jì)報(bào)告基因并結(jié)合恒溫核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)建立了基于CRISPR的診斷系統(tǒng)(CRISPR-based diagnostic, CRISPR-dx)。其可提供渺摩爾級(jí)(attomolar, aM, 10-8mol/L)的具有單堿基錯(cuò)配敏感性和特異性的快速核酸(DNA或RNA)檢測(cè)方法。該方法既可用于基因組中單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析，也可用于監(jiān)測(cè)血液中極少量的腫瘤 DNA。鑒于其高敏感性，該系統(tǒng)被稱為SHERLOCK(Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)，可被用于檢測(cè)寨卡和登革熱病毒的特定毒株以及區(qū)分不同的其他病原菌。其后，該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)研究出了進(jìn)一步優(yōu)化的SHERLOCK version2(SHERLOCK v2)[16]。

近期，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)常亞飛[17]等利用SHERLOCK系統(tǒng)，通過(guò)結(jié)合LwCas13a附帶切割效應(yīng)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification, RPA)技術(shù)，建立一種可以在37 ℃下恒溫進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸檢測(cè)的方法。該方法具有恒溫反應(yīng)、靈敏、特異、結(jié)果直觀、利于現(xiàn)場(chǎng)操作的特點(diǎn)。同時(shí)，由于SHERLOCK高度的錯(cuò)配敏感性，該技術(shù)可對(duì)序列高度同源的病毒株進(jìn)行區(qū)分。

4.3 基于CRISPR-Cas13的抗病毒研究 與Cas9 系統(tǒng)對(duì)DNA 病毒核酸的切割破壞效應(yīng)相似，Cas13的RNA特異性靶向切割能力可用于拮抗RNA病毒，以及復(fù)制過(guò)程中有RNA中間體的DNA病毒。Rashid Aman[18]以及Xiaohui Zhan[19]等人最早用LshCas13a系統(tǒng)干擾蕪菁花葉病毒(TuMV)以及馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)等植物病毒的復(fù)制增殖。近期Freije等[20]證明Cas13可被用于靶向和破壞多種感染哺乳動(dòng)物的ssRNA病毒的基因組。該研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)數(shù)百種可能感染人類的ssRNA病毒進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)了數(shù)千個(gè)Cas13 crRNA的潛在靶點(diǎn)，同時(shí)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cas13可拮抗淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)和水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)這3種不同的ssRNA病毒的增殖和復(fù)制。此外，該研究還分析了介導(dǎo)Cas13靶向作用的影響因素，確定了crRNA設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步優(yōu)化了該抗病毒方法，為后期該技術(shù)在抗病毒領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

5 展望

基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的核酸檢測(cè)以及抗病毒技術(shù)將在獸醫(yī)研究領(lǐng)域大有可為，原因有三：(1)SHERLOCK檢測(cè)系統(tǒng)具有高靈敏度、特異性、可恒溫反應(yīng)、結(jié)果直觀、利于現(xiàn)場(chǎng)操作的特點(diǎn)，非常利于開(kāi)發(fā)可在養(yǎng)殖場(chǎng)和動(dòng)物醫(yī)院現(xiàn)場(chǎng)使用的核酸檢測(cè)試紙條，這為開(kāi)發(fā)輕量化、便捷的檢測(cè)技術(shù)提供了重要思路；(2)SHERLOCK具有高度的錯(cuò)配敏感性，該技術(shù)可對(duì)序列高度同源的病毒株進(jìn)行區(qū)分；(3)基于CRISPR-Cas13的抗病毒策略在動(dòng)物疫病的預(yù)防治療研究中較人類有更低的試錯(cuò)成本。同時(shí)，該技術(shù)還可與轉(zhuǎn)基因抗病育種技術(shù)相結(jié)合，以培育對(duì)某種疾病具有天然抗性的動(dòng)物。

雖然CRISPR-Cas13技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，但目前該技術(shù)仍有諸多不足有待解決。首先，sgRNA對(duì)靶位點(diǎn)的正確識(shí)別需要特定PAM序列，降低了靶區(qū)選擇和相應(yīng)sgRNA設(shè)計(jì)的靈活性，也使sgRNA的設(shè)計(jì)更加復(fù)雜化。其次，crRNA與目標(biāo)核酸序列的結(jié)合可容忍一定程度的錯(cuò)配，進(jìn)而導(dǎo)致脫靶效應(yīng)(off-target effect)，阻礙了 CRISPR-Cas系統(tǒng)在生產(chǎn)實(shí)踐中的使用。當(dāng)前主要通過(guò)sgRNA和PAM序列的設(shè)計(jì)以及CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)化(Cas的構(gòu)象和Cas-sgRNA的用量等)3個(gè)方面進(jìn)行降低脫靶效率的研究來(lái)提升其作用的準(zhǔn)確性。再者，基因編輯效率(efficiency of genome editing)的提高對(duì)于CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用同樣重要。此外，由于RNA酶的廣泛存在，核酸的檢測(cè)和編輯很容易受到影響，因此，在CRISPR-Cas系統(tǒng)中偏向使用更長(zhǎng)的sgRNA來(lái)放大核酸檢測(cè)信號(hào)，以確保sgRNA沒(méi)有被RNase消化變短或降解，從而有效避免假陰性結(jié)果[21]。而CRISPR-Cas13技術(shù)若想真正用于臨床開(kāi)發(fā)，其Cas13 蛋白以及gRNA在體內(nèi)的精確遞呈、代謝消除、免疫激活反應(yīng)以及其他安全性相關(guān)指標(biāo)均需要系統(tǒng)評(píng)估。若能解決以上諸多問(wèn)題，將有利于Cas13技術(shù)的進(jìn)一步完善，為傳染病快速、準(zhǔn)確的診斷以及抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路和技術(shù)。