王秀麗 ， 劉 博 ， 辛凌翔 ， 杜 微 ， 鄧智昕 ， 巫月生 ，袁 沐 ， 李 建 ， 張一幟 ， 彭國(guó)瑞 ， 蔣玉文 ， 張 媛

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司 ， 廣東 肇慶 526238 ；3.廣東永順生物制藥股份有限公司 ， 廣東 廣州 511356)

巴氏桿菌病是由巴氏桿菌屬細(xì)菌所致動(dòng)物的傳染病，可引起多種畜禽出血性敗血癥，故稱為多殺性巴氏桿菌病[1]，《中國(guó)獸藥典》二一五年版[2]收錄的活疫苗有禽多殺性巴氏桿菌病活疫苗(B26-1200株)、禽多殺性巴氏桿菌病活疫苗(G190E40株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(679-230株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(C20株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗，活菌計(jì)數(shù)是以上多殺性巴氏桿菌類活疫苗的重要參數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確對(duì)于控制疫苗的安全性和免疫效力也有重要意義。在生物制品檢驗(yàn)中增加參考品以更客觀、科學(xué)的評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果是未來(lái)的一種趨勢(shì)，國(guó)外以及國(guó)內(nèi)人用生物制品參考品的研究及應(yīng)用越來(lái)越廣泛[2-3]。

活菌計(jì)數(shù)受到多種因素影響，如培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)條件、平板表面濕度、檢驗(yàn)員的主觀差異等，導(dǎo)致按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程計(jì)數(shù)結(jié)果不一致。在近幾年檢驗(yàn)中，多次出現(xiàn)初次檢驗(yàn)不符合規(guī)定，更換培養(yǎng)基或檢驗(yàn)員重檢符合規(guī)定的情況。目前我國(guó)尚無(wú)活菌計(jì)數(shù)的參考品，也無(wú)控制培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力的參考品，對(duì)影響活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的關(guān)鍵因素?zé)o法科學(xué)評(píng)價(jià)，更無(wú)法評(píng)價(jià)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的有效性。活菌計(jì)數(shù)的參照物在美國(guó)細(xì)菌類疫苗如多殺性巴氏桿菌和豬丹毒桿菌活疫苗的檢驗(yàn)中已應(yīng)用多年[4-5]。我國(guó)沙門(mén)菌類活菌計(jì)數(shù)參考品的研究已經(jīng)完成[6]，并已初步應(yīng)用于沙門(mén)菌類活疫苗活菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)中，也在檢驗(yàn)用普通瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量控制中應(yīng)用。本研究試圖研制多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計(jì)數(shù)參考品，以期更加科學(xué)評(píng)價(jià)多殺性巴氏桿菌類疫苗活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 參考品候選物的制備及分發(fā) 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》[7]的方法，制備一批(500瓶)豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)，作為參考品候選物。按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》三部對(duì)參考品候選物的性狀、純粹、活菌計(jì)數(shù)、真空度測(cè)定、剩余水分等參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。從500 瓶參考品候選物中隨機(jī)抽取100 瓶，置于隔熱泡沫塑料盒內(nèi)，并放入生物冰袋，最外層包裝紙箱，快遞至A單位、B單位和C單位，收到樣品后立即置于-70 ℃以下冰箱中保存[8]。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及耗材 用6批原材料按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》二年版附錄配制6批馬丁瓊脂，用上述培養(yǎng)基分別加入同一批健康牛血清和裂解血細(xì)胞全血，傾注平板，由2名檢驗(yàn)員分別對(duì)隨機(jī)抽取的3瓶參考品候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，篩選出適宜的培養(yǎng)基原材料。用篩選出的原材料制備馬丁肉湯和馬丁瓊脂培養(yǎng)基，密封后于2～8 ℃保存。健康牛血清,購(gòu)自Gibco公司，裂解血細(xì)胞全血由本實(shí)驗(yàn)室制備。1 mL、10 mL一次性吸管購(gòu)自Costar公司，一次性平皿(直徑90 mm),購(gòu)自青島金典生化器材公司。A、B、C三家單位所用的試驗(yàn)耗材完全一致。

1.3 均一性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[9]的方法。

1.4 協(xié)作標(biāo)定 分別隨機(jī)抽取100 瓶參考品候選物、100瓶馬丁瓊脂(100 mL/瓶)、100瓶馬丁肉湯(240 mL/瓶)及相關(guān)耗材寄給B單位和C單位，A、B、C 3 家單位分別隨機(jī)抽取2 名檢驗(yàn)員，每位檢驗(yàn)員對(duì)3 瓶參考品候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每瓶疫苗進(jìn)行2 次重復(fù)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不同檢驗(yàn)員在不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果[10]。根據(jù)CNAS-GL02:2006 《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[9]中穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)算Z比分值，剔除結(jié)果不滿意的數(shù)據(jù)，計(jì)算活菌計(jì)數(shù)的幾何平均數(shù)±2SD作為參考品候選物的菌數(shù)范圍。

1.5 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn) B單位和C單位分別從100瓶參考品候選物中隨機(jī)抽取5 瓶用1.1的方式寄到A單位，A單位收到樣品后馬上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，運(yùn)輸過(guò)程均需2 d，分析運(yùn)輸過(guò)程對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。夏季(7月份)和冬季(12月份)分別試驗(yàn)1次。

1.6 加速破壞試驗(yàn) 隨機(jī)抽取參考品候選物，分別置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃條件下，2～8 ℃、25 ℃、37 ℃條件下保存的樣品每隔若干天隨機(jī)抽取3瓶進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)、-20 ℃保存的樣品每隔6個(gè)月隨機(jī)抽取3瓶進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，分析樣品在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性[11]。

1.7 保存期試驗(yàn) 將置于-70 ℃以下保存的參考品候選物按1.4的方法每1～2個(gè)月取樣并計(jì)數(shù)，至保存期24個(gè)月，對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每隔6個(gè)月對(duì)其性狀、真空度、剩余水分測(cè)定1次。

1.8 參考品的應(yīng)用 2017-2019年多殺性巴氏桿菌類疫苗活菌計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)中，加入?yún)⒖计纷鳛閷?duì)照，每次檢驗(yàn)隨機(jī)抽取3瓶參考品，其中至少2瓶參考品計(jì)數(shù)結(jié)果在標(biāo)定范圍內(nèi)時(shí)對(duì)照成立，對(duì)待檢疫苗進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 參考品候選物的檢驗(yàn) 參考品候選物性狀為海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，隨機(jī)抽取5瓶疫苗進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，結(jié)果5/5純粹，真空度測(cè)定結(jié)果顯示，參考品呈白色或粉色或紫色輝光，隨機(jī)抽取4瓶參考品測(cè)定剩余水分，結(jié)果為1.4%、1.5%、1.4%、2.2%，均小于3.0%，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為4.5×108CFU/頭份。

2.2 培養(yǎng)基的篩選 由2名檢驗(yàn)員用6批馬丁瓊脂培養(yǎng)基(含4%健康牛血清和0.1%裂解血細(xì)胞全血)對(duì)相同的3瓶樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。2名檢驗(yàn)員對(duì)6瓶樣品計(jì)數(shù)結(jié)果的中位數(shù)均為2號(hào)培養(yǎng)基(表1)，故選2號(hào)培養(yǎng)基的原材料配制馬丁瓊脂300瓶，100 mL/瓶，配制馬丁肉湯400瓶，240 mL/瓶，均密封后置于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 參考品用6批馬丁瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 均一性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，對(duì)隨機(jī)抽取的10瓶參考品候選物計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)為5.4%，小于10%，說(shuō)明均一性良好(表2)[12]。

表2 均一性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 協(xié)作標(biāo)定 A、B、C 3 家單位6名檢驗(yàn)員對(duì)18 瓶參考品候選物計(jì)數(shù)結(jié)果為(×108CFU/頭份)：5.0，4.9，5.3，5.9，4.9，4.6，4.9，5.4，4.2，4.4，5.3，4.9，5.0，4.6，4.5，5.0，4.8，4.6，5.4，5.3，5.2，5.3，5.2，5.3，4.9，4.9，4.6，4.9，4.9，4.5，4.7，4.5，4.3，4.8，4.4，4.6。用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)法分析， 36/36結(jié)果滿意，對(duì)36個(gè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，XM±2SD為(4.2，5.6)×108CFU，定為該批次參考品候選物活菌數(shù)的標(biāo)定范圍。

2.5 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn) 第1次運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)(冬季，12月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考品候選物計(jì)數(shù)結(jié)果的最小值分別為4.3×108CFU/頭份和4.2×108CFU/頭份；第2次運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)(夏季，7月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考品候選物計(jì)數(shù)結(jié)果的最小值分別為4.3×108CFU/頭份，4.5×108CFU/頭份。本參考品候選物保存期0個(gè)月時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果為4.5×108CFU/頭份，運(yùn)輸后計(jì)數(shù)結(jié)果與之前無(wú)明顯差異，說(shuō)明該參考品候選物在48 h內(nèi)的運(yùn)輸穩(wěn)定性良好(表3)。

表3 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加速破壞試驗(yàn) 加速破壞試驗(yàn)結(jié)果顯示，25 ℃保存4 d，結(jié)果穩(wěn)定，保存10 d，菌數(shù)下降15%；37 ℃保存2 d，結(jié)果穩(wěn)定，保存10 d，菌數(shù)下降31%(表4)；真空度良好的條件下，4 ℃保存30 d菌數(shù)穩(wěn)定；失真空后菌數(shù)在2～8 ℃保存菌數(shù)也會(huì)很快下降(表5)；-20 ℃保存的疫苗24個(gè)月內(nèi)菌數(shù)無(wú)下降，結(jié)果穩(wěn)定。

表4 參考品候選物加速破壞試驗(yàn) (37 ℃、25 ℃)

2.7 保存期試驗(yàn) 按協(xié)作標(biāo)定的方法對(duì)-70 ℃以下保存24個(gè)月以內(nèi)的參考品候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，剔除結(jié)果不滿意的偏離數(shù)據(jù)，變異系數(shù)為7.2%～8.6%，均小于10%，平均數(shù)為4.7×108～4.8×108CFU/頭份，中位數(shù)為4.6×108～4.7×108CFU/頭份，均在活菌計(jì)數(shù)可接受的誤差范圍內(nèi)，且計(jì)數(shù)結(jié)果在24個(gè)月內(nèi)未隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，保存期為6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月時(shí)分別隨機(jī)抽取參考品候選物檢查性狀、真空度，結(jié)果均符合《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定，剩余水分均小于3%[13]。

表5 參考品候選物加速破壞試驗(yàn)(2～8 ℃)

2.8 參考品的應(yīng)用 本參考品在應(yīng)用過(guò)程中主要存在5種情況：(1)參考品對(duì)照成立，待檢疫苗不符合規(guī)定，這種情況下更換培養(yǎng)基重檢，檢測(cè)結(jié)果均與初次檢驗(yàn)結(jié)果一致；(2)參考品符合規(guī)定，待檢疫苗不符合規(guī)定，但二者在37 ℃培養(yǎng)24 h菌落大小不一； (3)待檢疫苗和參考品結(jié)果均不符合規(guī)定，更換培養(yǎng)基對(duì)待檢疫苗和參考品重檢測(cè)，參考品結(jié)果符合規(guī)定，對(duì)待檢疫苗進(jìn)行判定；(4)待檢疫苗和參考品均符合各自質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；(5)參考品不符合規(guī)定，待檢樣品符合規(guī)定，重檢后均符合規(guī)定(表6)。

表6 參考品的應(yīng)用情況

3 討論

通過(guò)對(duì)多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計(jì)數(shù)參考品的系統(tǒng)研究，制定出參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：性狀、純粹檢驗(yàn)、真空度測(cè)定、剩余水分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)獸藥典》；活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為隨機(jī)抽取3瓶樣品，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄用馬丁瓊脂和馬丁肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)有不少于2瓶參考品的計(jì)數(shù)結(jié)果在標(biāo)定范圍內(nèi)。當(dāng)有大于1瓶計(jì)數(shù)結(jié)果不在標(biāo)定范圍內(nèi)或(37±0.5)℃培養(yǎng)18-24 h菌落大小不一時(shí)，應(yīng)更換培養(yǎng)基重檢1次。均一性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為隨機(jī)抽取10瓶參考品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果的變異系數(shù)應(yīng)小于10.0%；運(yùn)輸穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)為將參考品置于2～8 ℃運(yùn)輸不超過(guò)48 h，活菌數(shù)下降應(yīng)小于10.0%。

多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計(jì)數(shù)參考已監(jiān)測(cè)的保存期為2年，如臨期需換批時(shí)，對(duì)在保存期內(nèi)的參考品用馬丁瓊脂進(jìn)行計(jì)數(shù)，如果計(jì)數(shù)結(jié)果在標(biāo)定范圍內(nèi)，說(shuō)明馬丁瓊脂的促生長(zhǎng)能力適宜，用該馬丁瓊脂對(duì)新制備的參考品進(jìn)行檢驗(yàn)和協(xié)作標(biāo)定，以確保參考品在換批時(shí)標(biāo)準(zhǔn)一致[14]。

參考品的應(yīng)用結(jié)果顯示，本品可以應(yīng)用于控制多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計(jì)數(shù)的過(guò)程。每次檢驗(yàn)均需用參考品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的有效性進(jìn)行判定。若一次檢驗(yàn)中使用同一批培養(yǎng)基對(duì)多批檢品進(jìn)行檢驗(yàn)，則僅需用3瓶參考品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的有效性進(jìn)行判定。若一次檢驗(yàn)使用不同批次的培養(yǎng)基，則每批培養(yǎng)基均需用3瓶參考品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有效性判定。當(dāng)3瓶參考品中至少2瓶計(jì)數(shù)結(jié)果在參考品標(biāo)定范圍內(nèi)，且(37±0.5)℃培養(yǎng)24 h菌落大小均勻一致時(shí)，判定試驗(yàn)結(jié)果有效。

因豬丹毒活疫苗和巴氏桿菌類活疫苗檢驗(yàn)均需用馬丁瓊脂，但對(duì)馬丁瓊脂的適應(yīng)性不一致。豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗活菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)中，豬丹毒生長(zhǎng)狀態(tài)良好，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果符合規(guī)定。而多殺性巴氏桿菌未生長(zhǎng)，更換培養(yǎng)基后二者均生長(zhǎng)良好且計(jì)數(shù)結(jié)果符合規(guī)定，其原因待進(jìn)一步探索。因此，本參考品應(yīng)用于控制多殺性巴氏桿菌類疫苗檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量有重要意義。

本品應(yīng)用于控制多殺性巴氏桿菌類疫苗檢驗(yàn)用馬丁瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量時(shí)，每批培養(yǎng)基用3瓶參考品進(jìn)行檢驗(yàn)，當(dāng)不少于2瓶參考品計(jì)數(shù)結(jié)果在參考標(biāo)定范圍內(nèi)，且在(37±0.5)℃培養(yǎng)24 h，菌落大小均勻一致時(shí)，判定培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力符合規(guī)定。若參考品計(jì)數(shù)結(jié)果高于參考品標(biāo)定范圍，提示培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力偏高，反之則偏低。因此應(yīng)在多殺性巴氏桿菌類活疫苗檢驗(yàn)用培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中添加促生長(zhǎng)能力檢驗(yàn)參數(shù)，符合規(guī)定的培養(yǎng)基用于檢驗(yàn)，可以避免不必要的重復(fù)工作。多殺性巴氏桿菌類疫苗(包括滅活疫苗)的配苗及效力檢驗(yàn)(免疫攻毒法)也需計(jì)數(shù)。參考品的應(yīng)用對(duì)多殺性巴氏桿菌類疫苗的生產(chǎn)及檢驗(yàn)均具有重要的意義。

加速破壞試驗(yàn)結(jié)果顯示：用卡鉑瓶?jī)龈傻膮⒖计分糜?70 ℃以下保存時(shí)易失真空，失真空后菌數(shù)明顯下降，不能滿足應(yīng)用的要求。本實(shí)驗(yàn)室已用安瓿凍干本品，以保證參考品的真空度符合規(guī)定，其保存期可進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。