馬振邦 ， 李霄陽 ， 許 健 ， 王 萍 ， 李永清

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 江西 南昌 330045 ; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100097)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR )是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的急性，以呼吸道炎癥為主的病毒性傳染病[1]。牛傳染性鼻氣管炎病毒屬于皰疹病毒科，皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，為線狀雙股DNA病毒，基因組大小約為138 Kb，可編碼70 多種結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]。IBRV可侵襲多種器官和組織，在臨床上表現(xiàn)呼吸困難、鼻炎、高熱等癥狀，可引起嚴(yán)重的呼吸道疾病和生殖道疾病，導(dǎo)致動物產(chǎn)奶量降低、全身性感染及流產(chǎn)等[4]。目前，該病呈全球性分布，被世界動物衛(wèi)生組織列為 B 類動物疫病，是嚴(yán)重阻礙我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重大傳染病之一[5]。IBRV 的 VP8 蛋白是成熟病毒粒子中含量最豐富的被膜蛋白，由2 226 bp開放閱讀框編碼的 742 個氨基酸組成。VP8 的一級結(jié)構(gòu)和單純皰疹病毒Ⅰ型UL47 開放閱讀框同源，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]。VP8蛋白亞基上含有5個線性B細(xì)胞表位，其中sange1表位參與病毒的中和反應(yīng)[7]。Dunn等也發(fā)現(xiàn)VP8同全長的VP4片段一樣，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而激發(fā)免疫保護(hù)作用[8]。本試驗將 VP8 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)、純化，用純化蛋白對SPF小鼠進(jìn)行免疫，獲取抗體血清。通過Western Blot 驗證了重組VP8蛋白具有活性，為深入探究IBRV-VP8蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 參考NCBI已公布IBRV-VP8基因序列(基因序列號：AY530215.1)，設(shè)計擴(kuò)增IBRVVP8 全長基因片段(2 235 bp)，然后交由華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。該基因片段克隆于pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒中,形成重組質(zhì)粒(測序驗證準(zhǔn)確)，命名為pET-32a-VP8。氨芐青霉素、脫脂奶、Anti-His(HRP 標(biāo)記)，購自康為世紀(jì)公司；包涵體純化Ni柱填料，購自全式金生物技術(shù)有限公司；IPTG，購自TIANGEN公司；增強型HRP-DAB底物顯色，購自TIANGEN公司；2種Prestained protein蛋白Marker，購自Thermo公司；核酸小分子量Marker，購自北京索萊寶科技有限公司。6周齡SPF級BALB/c小鼠，購自北京梅利亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，按照動物福利要求，飼養(yǎng)在本實驗室動物房內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 VP8重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將表達(dá)IBRVVP8基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-VP8轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主Transetta(DE3)菌株內(nèi)，均勻涂布到含氨芐青霉素濃度為100 mg/mL的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

將pET-32a空載體和挑選的陽性菌各接種于5 mL的含氨芐青霉素(濃度為100 μg/mL)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖菌，待其菌液OD600值在0.4～0.6范圍內(nèi)時，取2.5 mL 陽性菌和pET-32a空載體加入IPTG至終濃度為0.5 mol/L誘導(dǎo)表達(dá)，剩余2.5 mL陽性菌不加 IPTG 誘導(dǎo)，一起放于37 ℃，200 r/min搖菌6 h。分別取陽性菌誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)和pET-32a空載體誘導(dǎo)1 mL，12 000 r/min離心5 min，加等量PBS將沉淀懸起來，再按4∶1加5×SDS上樣Buffer混勻后煮沸10 min，9 000 r/min離心1 min，取上清20 μL上樣，進(jìn)行蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色1 h，脫色并進(jìn)行凝膠成像儀分析。

1.2.2 融合蛋白的可溶性鑒定 取3個3 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，按1∶100接陽性菌，37 ℃ 200 r/min搖菌，待其OD600值在0.4～0.6范圍內(nèi)時，分別加等量IPTG誘導(dǎo)(0.5 mol/L)，之后于16 ℃、25 ℃、37 ℃ 200 r/min搖菌6 h，取等量菌體超聲波裂解，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行蛋白電泳分析最佳誘導(dǎo)溫度，以及是否低溫誘導(dǎo)影響表達(dá)蛋白的可溶性。取陽性菌接菌于6個 3 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖菌，待其OD600值在0.4～0.6 范圍內(nèi)時，分別加IPTG終濃度為0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L、1.0 mol/L、1.25 mol/L、 1.5 mol/L誘導(dǎo)6 h，進(jìn)行蛋白電泳分析最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化 在最佳溫度和最佳IPTG濃度下誘導(dǎo)融合蛋白大量表達(dá)，8 000 r/min離心30 min取菌體沉淀，于Binding Buffer中重懸菌體，超聲裂解，并進(jìn)行過濾；打開Ni-NTA His-Bind Resin親和層析柱下端的塞子，讓預(yù)裝柱中的保護(hù)液平衡柱子之后慢速流出；用至少20 mL 的超純水緩慢沖洗Ni柱；用至少20 mL Binding Buffer 緩慢加入Ni柱，短暫停留后讓其緩慢自然流出，僅增加Ni柱的吸附能力；將重組蛋白溶液沿 Ni 柱管壁緩慢加入，控制Ni柱下端出口流速為5～6滴/min，將流過Ni柱的穿流液收集后再次上樣，以增加蛋白回收量；緩慢加入大約40 mL Washing Buffer 使其緩慢流出 Ni 柱；加入5 mL Elution Buffer于Ni柱中，放置30 min，調(diào)整較慢的流速(2～4滴/min)同時一直用考馬斯亮藍(lán) G250 檢測流出的蛋白液顏色變化，待藍(lán)色幾乎消失后停止收集；用 SDS-PAGE 檢測純化效果，將純化好的蛋白待復(fù)性任何溶液過柱子前都要經(jīng)過0.22 μm濾器過濾。蛋白復(fù)性：處理透析袋，將純化出來的蛋白透析在2 L的50 mM Tris、300 mM NaCl、4.5 mM 尿素透析液中，之后依次降低緩沖液中的尿素濃度3.5 mM、2.5 mM、2 mM、1.5 mM、1 mM、0.5 mM、0 mM 每個濃度透析8 h，最終透析到PBS中。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot分析 將純化的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后15 V，50 min 轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶的 PBST 4 ℃過夜封閉，使用抗 His 標(biāo)簽的鼠源單克隆抗體(1∶5 000 稀釋)孵育 1.5 h，然后用HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶10 000 稀釋)孵育 50 min，之后DAB 顯色，終止顯色。

1.2.5 多克隆抗體的制備 6周齡小鼠15只，按照免疫程序，每只于頸背部皮下多點注射復(fù)性蛋白50 μg，首免采用弗氏完全佐劑，之后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行3次加強免疫，每次免疫間隔 2 周。免疫完成后第2周進(jìn)行眼球采血，每隔2 d采1次，分離血清，-80 ℃凍存。 將純化的目的蛋白和純化的病毒BoHV-1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后15 V，50 min轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶的 PBST 4℃過夜封閉，使用鼠抗VP8多克隆抗體陽性血清(1∶500 稀釋)孵育1.5 h，然后用HRP標(biāo)記的羊抗鼠的抗體(1∶10 000 稀釋)孵育50 min，之后DAB顯色，終止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP8蛋白的原核表達(dá) 由華大基因科技服務(wù)有限公司優(yōu)化構(gòu)建的pET-28a-VP8，未見表達(dá)，用EcoRI與XhoI雙酶切轉(zhuǎn)于pET-32a 載體上，VP8片段大小為2 235 bp，加上pET-32a上的標(biāo)簽，融合蛋白分子量約為110 kDa。如圖1，pET-32a空載體和未誘導(dǎo)的pET-32a-VP8無特異性條帶表達(dá)，誘導(dǎo)的pET-32a-VP8顯示110 kDa左右條帶。

圖1 pET-32a-VP8融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果

2.2 融合蛋白的可溶性分析 16 ℃、25 ℃、37 ℃分別誘導(dǎo)pET-32a-VP8后，超聲裂解細(xì)胞，對上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，如圖2，誘導(dǎo)的pET-32a 空載體和pET-32a-VP8未誘導(dǎo)未見目的條帶， pET-32a-VP8 誘導(dǎo)后可見目的條帶，pET-32a-VP8 誘導(dǎo)后上清未見目的條帶，pET-32a-VP8 誘導(dǎo)后沉淀中可見110 kDa的目的條帶，說明融合蛋白以包涵體的形式存在，并在37 ℃時蛋白表達(dá)量較高。

2.3 融合蛋白的最佳IPTG濃度 將pET-32a-VP8在最佳溫度37 ℃時，搖菌至OD600值于0.4～0.6之間時，加不同濃度的 IPTG誘導(dǎo)6 h，取等量菌體，離心，變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖3，結(jié)果為在1.0 mol/L時融合蛋白條帶最粗，表明在IPTG濃度為1.0 mol/L時，蛋白表達(dá)量最大。

2.4 融合蛋白的純化結(jié)果 His-Ni柱純化蛋白，上柱前樣品、上柱后流出液、Washing Buffer 洗脫組分、Elution Buffer洗脫組分，每階段分別取100 μL，進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳分析，如圖4顯示，表明純化結(jié)果良好。

圖2 融合蛋白的可溶性分析

圖3 不同 IPTG 濃度誘導(dǎo)

圖4 pET-32a-VP8 蛋白純化結(jié)果

2.5 Western Blot分析 將純化的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶的 PBST 4 ℃過夜封閉，一抗為抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體孵育1.5 h，二抗用HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG孵育50 min，之后DAB顯色，終止顯色。結(jié)果如圖5顯示條帶正確，驗證VP8的表達(dá)，非特異性條帶較少，表明純化效果良好。

2.6 多克隆抗體的制備 將純化的目的蛋白和純化的病毒IBRV進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶的PBST 4 ℃過夜封閉，先用鼠抗VP8多克隆抗體陽性血清，然后用HRP 標(biāo)記的羊抗鼠的抗體，Western Blot檢測。如圖6和圖7，結(jié)果表明，特異性良好，此多抗可以與純化的病毒特異結(jié)合，說明有免疫原性。

圖5 融合蛋白的WB結(jié)果

圖6 純化蛋白與多克隆抗體的 WB

圖7 純化病毒 IBRV與多克隆抗體的WB

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)，又名牛皰疹病毒1型(BHV-1),是引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病的病原[8-9]。我國大部分省市地區(qū)的奶牛、黃牛、水牛和牦牛均有不同程度感染。牛是IBRV的唯一感染宿主，牛感染后在自然條件下形成潛伏感染且不定期排毒[10]。VP8 蛋白是牛傳染性鼻氣管炎病毒IBRV的殼膜蛋白，大小約為97 kDa[11]，對病毒于牛體內(nèi)的復(fù)制是必需的。在牛體內(nèi)，VP8 刺激 T 細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗體，VP8可以導(dǎo)致體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以這個蛋白很重要。病毒感染宿主細(xì)胞后，大部分衣殼蛋白被釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表明這些蛋白是最初與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相互作用的物質(zhì)[12]。皰疹病毒衣殼蛋白有多種功能，包括病毒衣殼運輸、DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)、病毒的組裝與釋放。這些功能提示衣殼蛋白為病毒復(fù)制提供合適的環(huán)境，而 VP8 蛋白就是其中之一的衣殼蛋白。VP8在IBRV病毒粒子中是最多的蛋白[13]，與病毒對牛的致病力有關(guān)[14]。病毒進(jìn)入細(xì)胞后2 h，VP8就大量出現(xiàn)，在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭[15]。目前關(guān)于 VP8 結(jié)構(gòu)和功能的研究相對較少，其中一些是關(guān)于VP8磷酸化的研究，研究表明，IBRV的VP8單純皰疹病毒1型(HSV-1)的VP13/14 同源，VP8是磷酸化和糖基化的蛋白，包含核定位信號和核輸出信號，病毒激酶 US3和蛋白激酶 CK2可使VP8磷酸化[16]。

通過EcoR I和XhoI酶進(jìn)行體外重組連接克隆，本試驗成功構(gòu)建了IBRV的pET-32a-VP8融合表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)后的pET-32a-VP8 在溫度37 ℃與IPTG濃度為1.0 mol/L時，蛋白表達(dá)量最高。通過His-Ni柱對包涵體融合蛋白VP8進(jìn)行了純化，并免疫小鼠成功獲得抗IBRV的VP8蛋白的多克隆抗體。Western Blot免疫印跡證明，IBRV-VP8能與制備的抗IBRV的VP8蛋白的小鼠多克隆抗體特異性結(jié)合，表明表達(dá)純化的融合蛋白VP8蛋白具有良好的免疫原性。本試驗構(gòu)建的IBRV的pET-32a-VP8表達(dá)載體、表達(dá)純化的融合蛋白以及獲得的小鼠多克隆抗體，為進(jìn)一步探究IBRV的VP8蛋白的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。