原 霖 , 楊 林 , 辛盛鵬 , 宋曉暉 , 董 浩 , 劉 洋 , 韓 燾 ,高旭年 , 李爾華 , 鐘鳳然 , 陳亞娜 , 王傳彬

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102618 ； 2.廣州邦德盛生物科技有限公司 ， 廣東 廣州 510000)

世界衛(wèi)生組織(WHO)于1997年發(fā)布了第一個(gè)核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-丙型肝炎核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，到目前為止已發(fā)布同類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)16種[1]。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制起步較晚，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)可查詢到的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也主要是涉及微生物及轉(zhuǎn)基因植物等領(lǐng)域。相比其他領(lǐng)域，我國(guó)獸醫(yī)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究更是較為滯后，目前獸醫(yī)領(lǐng)域的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只有2018年由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心研制的豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株(PRRSV LV)、豬繁殖與呼吸綜合征美洲變異株(PRRSV JXA1)、豬繁殖與呼吸綜合征美洲經(jīng)典株(PRRSV VR2332)3種核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。近年來獸醫(yī)領(lǐng)域的研究者們也對(duì)研制動(dòng)物病原核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)探索，主要為禽流感、新城疫和亞洲I型口蹄疫病毒等方面[2-4]，但這些研究成果未經(jīng)過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)委員會(huì)的評(píng)審，未形成有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。該病病程短，死亡率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，有著重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[5]。2018年8月3日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布我國(guó)首例非洲豬瘟疫情。截止2019年8月非洲豬瘟進(jìn)入中國(guó)1年，我國(guó)所有省份均有疫情發(fā)生，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部共發(fā)布疫情152起，累積撲殺生豬100余萬頭。目前非洲豬瘟無有效疫苗，唯一的防控手段只能加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全和進(jìn)行早期診斷檢測(cè)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也要求生豬生產(chǎn)環(huán)節(jié)、調(diào)運(yùn)環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)都需對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，并聯(lián)合市場(chǎng)監(jiān)管總局和工業(yè)和信息化部聯(lián)合下文要求豬肉制品加工企業(yè)也開展非洲豬瘟病毒檢測(cè)。在《OIE陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)》中，熒光定量PCR是檢測(cè)非洲豬瘟病毒的推薦方法，然而目前并沒有非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使得無法對(duì)各實(shí)驗(yàn)室的非洲豬瘟病毒的檢測(cè)能力以及商品化非洲豬瘟檢測(cè)試劑進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 主要試劑 E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit和OMEGA Gel Extraction Kit，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kitv2 and Master Mix，購(gòu)自thermo公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes，購(gòu)自伯樂公司；引物探針由英濰捷基有限公司合成。

1.2 主要儀器 KINGFISHER DUO自動(dòng)化核酸提取儀，QX200 Droplet Generator、QX200 Droplet Reader、QX200微滴式數(shù)字PCR儀，QuantStudio 3D Digital PCR System芯片式數(shù)字PCR儀，普通PCR儀，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器。

2 方法

2.1 pUC19-P72質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中上傳的ASFV的P72基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了含分別BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增P72基因全長(zhǎng)序列的特異性引物(ASFV 上游引物5′-CGGGATCCTTAGGTACTGTAACGCAGCA-3′和ASFV 下游引物5′-CGGAATTCATGGCATCAGGAGGAGCT-3′)。

對(duì)感染ASFV的病死豬病料組織研磨液進(jìn)行核酸提取和PCR擴(kuò)增。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行雙酶切。將經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶切的擴(kuò)增產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切的pUC19載體進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的克隆進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，并送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 pUC19-P72質(zhì)粒的提取 將經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的陽性克隆，接入 10 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)12-14 h。按OMEGA公司“E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit”試劑盒的操作說明書進(jìn)行質(zhì)粒的提取。

2.3 pUC19-P72質(zhì)粒的純度分析 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34796-2017規(guī)定，以及《分子克隆》有關(guān)試驗(yàn)要求，采用紫外分光光度法對(duì)質(zhì)粒的純度進(jìn)行考察。純的DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，而A260/A230應(yīng)該達(dá)到2.0。

2.4 均勻性評(píng)估 隨機(jī)抽取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)30管樣本，每管樣本檢測(cè)3次。采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。使用單因素方差分析方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評(píng)估。

2.5 穩(wěn)定性評(píng)估 為了評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行了長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估和短期穩(wěn)定性評(píng)估。

2.5.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估 進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估的抽樣方法為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃的儲(chǔ)存條件下，在第1，2，4，6，9，12個(gè)月抽取5管非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)樣品檢測(cè)2次。使用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均值。使用回歸方法對(duì)非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估。

2.5.2 短期穩(wěn)定性評(píng)估 進(jìn)行短期穩(wěn)定性評(píng)估的抽樣方法可為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃、25 ℃、37 ℃環(huán)境下存放30 d、15 d、9 d。抽取3瓶的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)樣品檢測(cè)1次。使用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。使用回歸方法對(duì)非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行短期穩(wěn)定性評(píng)估。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值 非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值方式進(jìn)行定值。委托9家實(shí)驗(yàn)室，采用數(shù)字PCR方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行測(cè)量。定值數(shù)據(jù)進(jìn)行組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)、組間數(shù)據(jù)等精度檢驗(yàn)剔除可疑值。當(dāng)各組數(shù)據(jù)等精度時(shí)，用t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)平均值是否有顯著性差異。如平均值無顯著性差異，先合并數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性，在符合正態(tài)分布的情況下，可將多個(gè)平均值再次計(jì)算平均值，求出總平均值，即為標(biāo)準(zhǔn)值。

2.7 不確定度的評(píng)定 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說，其定值結(jié)果的不確定度由3部分組成，分別為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度ubb，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度us以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程引入的不確定度uchar。定值過程引入的不確定度分為不確定度的A類評(píng)定uA和不確定度的B類評(píng)定uB。不確定度A類評(píng)定通過測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法進(jìn)行；不確定度的B類評(píng)定是借助可利用的相關(guān)信息，進(jìn)行科學(xué)的分析判斷得到B類不確定度。將定值不確定度與均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性評(píng)估引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加就給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uCRM，該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴(kuò)展不確定度UCRM。

2.8 定值結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果表示為標(biāo)準(zhǔn)值±擴(kuò)展不確定度。

2.9 臨床試用 25家試用單位在檢測(cè)日常臨床樣本時(shí)，將試用的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行熒光定量PCR或者數(shù)字PCR檢測(cè)，一次檢測(cè)2管標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每管重復(fù)檢測(cè)3次，利用試用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)日常臨床樣品進(jìn)行標(biāo)定。嚴(yán)格按照產(chǎn)品的說明書對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、臨床樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR或者數(shù)字PCR定量檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)粒pUC19-P72的構(gòu)建 對(duì)感染ASFV的病死豬病料組織研磨液進(jìn)行核酸提取，并使用非洲豬瘟病毒P72基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ASFV的P72基因全序列。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶切后，連接入pUC19載體。經(jīng)過PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序證明載體pUC19-P72構(gòu)建成功，酶切結(jié)果如圖2所示。公司測(cè)序結(jié)果顯示，插入的P72基因序列長(zhǎng)度為1 941個(gè)堿基，與我國(guó)非洲豬瘟病毒分離株ASFV-SY18同源性100%。

圖1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pUC19-P72質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

3.2 質(zhì)粒pUC19-P72的純度分析 對(duì)提取的pUC19-P72質(zhì)粒的純度和濃度進(jìn)行了4次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果顯示，pUC19-P72質(zhì)粒的A260/280值均在1.9左右，A260/230值均大于2，質(zhì)粒濃度的均值為179.75 ng/μL，說明質(zhì)粒的純度良好，滿足實(shí)際使用要求。

3.3 均勻性檢測(cè)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)隨機(jī)抽取的30管樣品，進(jìn)行的90次檢測(cè)數(shù)據(jù)。根據(jù)自由度(v1,v2)及給定的顯著性水平α，可由表查臨界值的F值，算得F

表1 均勻性檢測(cè)結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

3.4.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估則是測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件下(-20 ℃)的穩(wěn)定性，分別在第1，2，4，6，9，12個(gè)月對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。結(jié)果與分析：對(duì)非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的-20 ℃貯存條件下穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行分析，|β1|

表2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

3.4.2 短期穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃、25 ℃、37 ℃環(huán)境下存放30 d、15 d、9 d分別進(jìn)行了回歸分析，|β1|

表3 短期穩(wěn)定性結(jié)果

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果 委托9家實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字PCR方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行測(cè)量，非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為5.78×103拷貝/μL。

3.6 不確定度的評(píng)定

3.6.1 均勻性引入的不確定度 均勻性引入的不確定度包括試劑盒的精密度，儀器的精密度和人員操作所引入的不確定度，為A類不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sbb為1.12×102拷貝/μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelbb=2.1%

3.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度也涵蓋了儲(chǔ)存溫度的變動(dòng)性對(duì)標(biāo)物的影響、試劑盒穩(wěn)定性引入的不確定度和人員操作引入的不確定度，為A類不確定度。暫定產(chǎn)品有效期為12個(gè)月，則有效期t=12個(gè)月的穩(wěn)定性不確定度貢獻(xiàn)為：s(β1)=14.1拷貝/μL；us=1.7×102拷貝/μL；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urels=3.1%。

3.6.3 定值過程引入的不確定度 由定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u(A)由測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。u(A)=3.17E+02拷貝/μL；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)=5.5%。

不確定度的B類評(píng)定是根據(jù)有關(guān)的信息或經(jīng)驗(yàn)，判斷被測(cè)量的可能值區(qū)間，假設(shè)被測(cè)量值的概率分布，根據(jù)概率分布和要求的概率確定B類不確定度為2.0%。

3.6.4 標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評(píng)定 合成上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度分量，取擴(kuò)展因子k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度。非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度：UCRM=2×4.16 E+02=8.32E+02拷貝/μL。

3.7 定值結(jié)果的表示 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果表示為(5.8±0.9)×103拷貝/μL。

3.8 試用結(jié)果 委托25家獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了試用，試驗(yàn)結(jié)果表明該產(chǎn)品均一性良好、量值的準(zhǔn)確度高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，與動(dòng)物樣本的互通性良好。

3.9 評(píng)審結(jié)論 制備的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滿足了國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，通過全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)的評(píng)審。

4 討論

豬感染非洲豬瘟病毒后抗體產(chǎn)生的時(shí)間較晚，通常在感染7-9 d后才能血清出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，而在感染48 h后就能檢測(cè)到非洲豬瘟病毒核酸的存在。因此，在非洲豬瘟病毒的檢測(cè)方法中，與其他檢測(cè)方法相比，核酸擴(kuò)增技術(shù)更為方便、快捷和準(zhǔn)確，對(duì)于非洲豬瘟的早期診斷意義重大。除此之外，由于核酸擴(kuò)增技術(shù)具有較高的特異性和敏感性，不僅可以檢測(cè)豬的唾液、血清、血漿、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物，還可以對(duì)環(huán)境樣品、排泄物、飼料、食品等多種類型樣品進(jìn)行檢測(cè)[6-7]，使得核酸檢測(cè)的應(yīng)用范圍更加廣泛。根據(jù)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心公布的第2次非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)名單，通過專家評(píng)審的34種非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒全部為采用核酸擴(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)品，其中熒光定量PCR類28種，等溫?cái)U(kuò)增類6種[8]。

鑒于非洲豬瘟病毒感染豬的特性以及當(dāng)前我國(guó)非洲豬瘟流行和檢測(cè)的現(xiàn)狀，迫切需要一種非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而滿足養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、流通環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒診斷的使用需求。因此本研究中研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》(JJF1343-2012)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性和穩(wěn)定性評(píng)估。均勻性評(píng)估分別對(duì)樣品內(nèi)和樣品間進(jìn)行了檢測(cè)，穩(wěn)定性評(píng)估分別對(duì)-20 ℃、4 ℃、25 ℃和37 ℃的保存效果進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性都能夠滿足相關(guān)要求。通過多家實(shí)驗(yàn)室的臨床試用，該產(chǎn)品均一性良好、量值的準(zhǔn)確度高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，與動(dòng)物樣本的互通性良好。綜上所述，本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過評(píng)價(jià)滿足了國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，最終通過了全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)的評(píng)審。

本試驗(yàn)中研發(fā)的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的實(shí)驗(yàn)室校準(zhǔn)、建立計(jì)量溯源性、為其他材料賦值、測(cè)量方法/程序的確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或?qū)嶒?yàn)室間質(zhì)量控制量值傳遞、評(píng)價(jià)和控制測(cè)試方法、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制等用途。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制為促進(jìn)非洲豬瘟病毒的核酸檢測(cè)水平的提高，為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和非洲豬瘟凈化提供了有效的工具，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。