格桑卓瑪 , 周賽賽 , 任晨瑋,3 , 王彪雄,3 , 錢雯嫻 ， 李天嬌 ， 朱家平 ， 索朗斯珠

(1.西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 ， 西藏 拉薩 850000 ; 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 ，西藏 林芝 860000 ; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 湖北 武漢 430070)

流行性感冒(Influenza，簡稱流感)，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是首個實施全球性監(jiān)測的傳染病[1]。禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類疾病綜合征。禽流感病毒(Avian influena virus，AIV)屬正黏病毒科，基因由單股、負(fù)鏈、8段不連續(xù)片段RNA構(gòu)成，因表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原差異，迄今已分為18個HA亞型、11個NA亞型[2-4]。自2009年的甲型H1N1流感大流行以來，每年全世界因流感而導(dǎo)致死亡的人數(shù)高達(dá)百萬[5]。流感病毒目前有甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)型，甲型流感病毒因抗原變異、傳染性大、傳播快等因素，易發(fā)生大范圍的流行；尤其是A型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亞型流感比B型流感感染更嚴(yán)重[6]。因此，應(yīng)加強對H5N1亞型高致病性禽流感病毒的基因的遺傳進化分析的研究，對防控高致病性禽流感的大規(guī)模傳播具有至關(guān)重要意義。本試驗對西藏部分地區(qū)采集的拭子分離出的1株H5N1流感病毒，通過對HA和NA基因克隆，基因測序和分子生物學(xué)方法對得到的西藏株H5N1亞型高致病性禽流感病毒的HA和NA基因進行遺傳進化分析，通過本試驗旨在外界能夠了解西藏地區(qū)H5N1高致病性流感病的分布和基因遺傳進化，也為西藏預(yù)防高致病性禽流感病毒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和雞胚 1株H5N1亞型禽流感病毒分離于西藏地區(qū)，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室分離保存，經(jīng)RT-PCR試驗鑒定為H5N1亞型禽流感病毒[7]；9-11日齡SPF雞胚由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 TRIzol LS?Reagent試劑盒，購自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTPs、DNA Marker(DL-5 000)、rTaqDNA聚合酶等，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物設(shè)計見表 1，由北京奧克鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 紫外-可見分光光度計(NanoDrop 2000賽默飛)、9902型PCR儀器(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠)、Image Lab Version 3.0凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)等。

表1 引物序列信息

1.2 方法

1.2.1HA和NA基因克隆和測序 用1.7%的瓊脂糖凝膠將擴增的PCR產(chǎn)物進行電泳，并用凝膠成像儀觀察目的條帶大小，在紫外燈下將HA和NA預(yù)期大小的目的條帶切除，用膠回收試劑盒回收DNA?？寺∧康幕蜻B接反應(yīng)總體系為20 μL，10 μL PCR回收產(chǎn)物、9.0 μL Ligation Solution I、1.0 μL pMD18-T，16 ℃水浴過夜連接。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑單菌落在LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR擴增，對陽性克隆子菌液送生工生物工程(上海)股行有限公司測序。

1.2.2HA和NA基因序列分析 用DNASTAR軟件中的Editseq拼接基因序列，通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對。利用Clustal W Method將病毒株HA和NA基因分別與NCBI中參考毒株進行同源性比較，利用MEGA 7.0軟件，通過鄰位相連法構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹，分析H5N1禽流感病毒分離株HA、NA基因遺傳進化情況，利用NetNGlyc 1.0 Server進行序列糖基化位點分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。

2 結(jié)果

2.1HA和NA基因克隆和測序 陽性質(zhì)粒PCR結(jié)果凝膠成像見圖1。經(jīng)過測序，獲得HA序列1 704 bp，NA序列1 350 bp；NCBI比對結(jié)果表明，該西藏毒株為H5N1亞型禽流感病毒，并命名為A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)；將獲得測序結(jié)果上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號為MN056891(HA)，MN056973(NA)。

圖1 H5N1禽流感病毒HA基因和NA基因

2.2HA基因序列分析

2.2.1HA基因同源性和進化樹分析 對西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)的HA基因與參考毒株做同源性分析，該毒株與其他50份參考毒株同源性在97.3%～99.4%之間，與2012年孟加拉國分離的雞源H5N1流感病毒同源性高達(dá)99.4%。通過MEGA7.0對西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)的HA基因和50份參考毒株HA基因做進化樹分析，結(jié)果見圖2：可知西藏分離株與孟加拉國分離的禽源(KF888522.1)、吉林分離的野鴨源(JX534573.1)、湖南分離的鴨源(CY146692.1)、盤錦分離的大山雀源(KJ907623.1)、黑龍江分離的野鴨源(KJ907639.1)的H5N1亞型禽流感病毒親緣性較近，同在一個主分支上，根據(jù)WHO公布的標(biāo)準(zhǔn)毒株參考發(fā)現(xiàn)，該西藏毒株與孟加拉國的H5N1亞型禽流感病毒親緣性最近，在同一小分支上，并且該譜系在亞洲地區(qū)較流行。

圖2 H5N1禽流感病毒HA基因遺傳進化樹

2.2.2HA基因關(guān)鍵位點分析 由表2可知：西藏分離株和其他參考毒株的HA裂解位點氨基酸序列均為“PQRERRRKR”，含有4個以上的堿性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒HA氨基酸裂解位點的分子特性，從分子生物學(xué)角度證明了分離的西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)為高致病性禽流感病毒。

表2 H5N1亞型AIV的HA氨基酸裂解位點

對西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)和6株參考毒株的HA蛋白糖基化位點預(yù)測結(jié)果見表3。通過對9個潛在的糖基化位點分析，西藏毒株潛在糖基化位點有7個，在氨基酸16、156位點不是潛在糖基化位點，與吉林、香港分離株相比少了1個156位潛在的糖基化位點，與孟加拉國、湖南、盤錦、黑龍江的分離株HA蛋白潛在糖基化位點相同。潛在糖基化位點的改變，可能會改變流感病毒HA蛋白抗原性、病毒毒力和對宿主范圍的改變。

表3 H5N1亞型AIV的HA蛋白的潛在糖基化位點

2.3NA基因序列分析

2.3.1NA基因同源性和進化樹分析 對西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)的NA基因與參考毒株做同源性分析，與參考毒株同源性在97.4%～99.5%之間，與2012年孟加拉國分離的雞源H5N1流感病毒NA基因同源性最高為99.5%。

西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)的NA基因和參考毒株NA基因建立進化樹見圖3。可知西藏分離株與孟加拉國分離的禽源(KF888524.1)、湖南分離的鴨源(CY146694.1)、黑龍江分離的野鴨源(KJ907641.1)、盤錦分離的大山雀源(KJ907625.1)的H5N1亞型禽流感病毒親緣性較近，來自同一個主分支，與孟加拉國的H5N1亞型禽流感病毒NA基因親緣性最近，同在進化樹的小分支上。

2.3.2NA基因糖基化位點分析 NA蛋白潛在糖基化位點較少，但其潛在位點和孟加拉國分離毒株一致，側(cè)面反映了兩毒株的親緣性較近，因NA蛋白不包含信號肽，即使它們含有潛在的糖基化位點，沒有信號肽的蛋白質(zhì)不太可能糖基化，見表 4。

3 討論

H5N1亞型禽流感病毒嚴(yán)重威脅著國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)。自1996年H5N1亞型高致病性禽流感病毒在亞洲從鵝體內(nèi)被分離以來，H5N1基因重組、突變，導(dǎo)致基因型復(fù)雜，并突破種間屏障，從家禽感染候鳥，逐漸感染哺乳動物和人，高致病性禽流感病毒宿主范圍、地域性不斷擴大[8-10]。Tian H等[11]發(fā)現(xiàn)在每一個野生鳥類遷徙通道中，H5N1流感病毒暴發(fā)和病毒遷徙的時間是密切相關(guān)的。鴻雁、赤麻鴨、斑頭雁等鳥類均會遷徙過冬，其中鴻雁等多在中國南部和東南亞越冬，沿著東亞路線在蒙古或亞洲東北部繁殖，斑頭雁等在南亞越冬，沿著中亞遷徙在青海或蒙古繁殖。部分候鳥在遷徙過程中必定會攜帶H5N1亞型高致病性禽流感病毒。根據(jù)WHO/OIE/FAO等機構(gòu)和學(xué)者表示，H5N1亞型高致病性禽流感clade2.3.2系在中國、孟加拉國、越南、尼泊爾、蒙古、日本等亞洲地區(qū)均有流行[12-13]。

表4 H5N1亞型AIV的NA蛋白的潛在糖基化位點

本試驗的西藏H5N1亞型禽流感病毒，經(jīng)測序分析并命名為A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)。經(jīng)過同源性和基因進化樹分析，西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)和2012年孟加拉國分離H5N1高致病性禽流感病毒同源性最高、親緣性最近，為H5N1亞型clade2.3.2.1系。中國西藏雖與孟加拉國相隔較遠(yuǎn)，可推斷本次流感病毒很大程度上是有候鳥遷徙所致，具體何時傳入西藏還有待研究。本次發(fā)現(xiàn)也提醒西藏地區(qū)應(yīng)高度重視候鳥攜帶禽流感病毒。禽流感病毒的HA和NA基因是流感病毒表達(dá)較豐富的表面抗原，HA基因決定流感病毒毒力、致病性和宿主關(guān)系等因素，NA在病毒復(fù)制和變異中起作用[14-16]。高致病性流感病毒和低致病性流感病毒毒株的HA裂解位點堿性氨基酸個數(shù)有較大差異，高致病性毒株有多個，低致病性裂解位點僅有一個精氨酸[17-18]。該西藏毒株HA蛋白氨基酸裂解位點為PQRERRRKR，符合高致病性禽流感特征；HA蛋白有7個潛在糖基化位點，和香港毒株相比缺少了156位的潛在位點，糖基化位點的改變是否影響西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)毒力的改變，還需要進一步研究。

本試驗經(jīng)過對基因測序，利用分子生物學(xué)方法，對H5N1亞型流感病毒HA、NA基因進行分析，確定了西藏毒株A/chicken/Tibet/XZ1/2012(H5N1)的HA和NA基因(登錄號：MN056891、MN056973)均與2012年孟加拉國分離毒株親緣性最近，屬于高致病性禽流感病毒，對西藏預(yù)防高致病性H5N1亞型禽流感病毒感染具有重要意義。