楊 清 ， 劉巧榮 ， 孫 明 ， 李 濤 ， 喬明明 ， 鄧小雨 ， 楊欣艷 ， 王 慧 ， 陳西釗

(1.安徽省宿州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 安徽 宿州 234000 ； 2.北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司 ，北京 海淀 100094 ； 3.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州 貴陽 550008)

貓杯狀病毒(Feline Calicivirus, FCV)屬于杯狀病毒科杯狀病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，無囊膜，含有3個開放閱讀框[1]。貓科動物是該病毒的易感動物，主要表現(xiàn)為上呼吸道癥狀，如結(jié)膜炎、口腔炎、氣管炎，伴有雙向熱[2-3]。由于病毒毒力和宿主抵抗力不同，癥狀差異大，單獨的FCV不引起貓嚴重的致死性疾病，但混合感染時往往會加重病情[4]。

2015年7月貴州省某動物園1只3歲的東北虎首先發(fā)病，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，伴有發(fā)熱(39.6～40.8 ℃)、食欲不振、精神萎靡等，2-3 d后眼角膜水腫，眼房液變紅，隨后出現(xiàn)后軀運動障礙，背部痙攣等神經(jīng)癥狀；病程7 d后死亡。為了解病因，我們?nèi)〗M織樣品進行病毒分離，結(jié)果分離出了1株貓杯狀病毒，對其基因組進行測序分析，為老虎杯狀病毒感染的病原學(xué)、流行病學(xué)以及診斷、防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 總RNA提取試劑，購自Qiagen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；pMD19-T克隆載體、dNTP,購自TaKaRa公司；GoTaqDNA Polymerase,購自Promega公司；DH5α感受態(tài)細胞和DNA Marker,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品來源 貴州某動物園1只3歲東北虎出現(xiàn)結(jié)膜炎、口腔炎、氣管炎等癥狀，并伴有雙向熱；后軀運動障礙，背部痙攣；腹部腫脹，腹腔內(nèi)有積液。經(jīng)治療無效后死亡，采集鼻試子，脾臟凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病料處理 將老虎脾臟剪碎，研磨，加入DMEM培養(yǎng)基，制成1∶5的懸液，4 000 r/min離心15 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)貓腎上皮細胞(CRFK CCL-94)，待細胞長至單層處于對數(shù)生長期，棄培養(yǎng)液，接入已處理的病料樣品，37 ℃吸附 1 h，加入DMEM維持液，37 ℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察細胞病變情況(CPE)。5 d后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，進行盲傳，適時傳代至出現(xiàn)CPE，當80%的細胞出現(xiàn)CPE時收毒，-80 ℃反復(fù)凍融3次后，4 000 r/min離心15 min，取上清待檢。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 RT-PCR鑒定 按照北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的杯狀病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒(批號FC20171221P)說明書進行鑒定。

1.5.2 電鏡觀察 參考殷震等編著的《動物病毒學(xué)》[4]介紹的方法，對細胞培養(yǎng)液進行負染，進行電鏡觀察。

1.5.3 TCID50測定 將收獲的第5代病毒上清液用不含血清的DMEM培養(yǎng)基進行稀釋，每個稀釋度做8個重復(fù)，每孔接種100 μL，37 ℃孵育2 h。吸取病毒液，用PBS洗1遍，每孔加200 μL細胞維持液繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察并記錄CPE，5 d后判定結(jié)果，同時設(shè)陰性對照(維持液)。

1.6 全基因組測序與分析

1.6.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的FCV全基因組序列設(shè)計引物，引物序列見表1，引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.6.2 基因擴增 用RNA提取試劑盒從細胞培養(yǎng)上清中提取病毒全基因組，按照以下程序進行基因擴增：42 ℃ 45 min，95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用OMEGA公司膠回收試劑盒回收純化擴增的目的基因片段。

1.6.3 擴增產(chǎn)物的克隆及測序 分別將擴增得到的3個片段連接到pMD19-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。用PCR方法篩選陽性克隆，將初步鑒定的陽性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.6.4 FCV全基因組拼接以及序列同源性分析 應(yīng)用DNAMAN和DNASTAR對測序序列進行拼接，并將其與GenBank上發(fā)表的FCV序列進行同源性比對分析，并對其ORF1和ORF2編碼的蛋白氨基酸序列進行分析，繪制系統(tǒng)進化樹。分析所分離毒株的遺傳變異特征。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 細胞在接種第2代細胞培養(yǎng)物時，24 h即出現(xiàn)細胞變圓、脫落，呈散在魚籽樣(見圖2)。對照組細胞培養(yǎng)生長良好，未見細胞發(fā)生病變(見圖1)。將分離的病毒分別命名為FCV-YH/16。

圖1 正常細胞 (40×)

圖2 接毒后細胞病變 (40×)

2.2 病毒鑒定

2.2.1 RT-PCR鑒定 用貓杯狀病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒分別對細胞分離物進行鑒定，結(jié)果為陽性，表明分離的病毒為FCV(見圖3)。

圖3 實時熒光RT-PCR檢測

2.2.2 電鏡負染觀察 可見杯狀病毒粒子，呈圓形、橢圓形等形態(tài)。直徑約為30～40 nm。見圖4。

圖4 分離病毒電鏡圖片 (標尺=50 nm)

2.2.3 TCID50測定 按照Reed-Muench計算法進行計算，第5代細胞毒的病毒含量為107.5TCID50/mL。

2.3 基因的測序及序列分析

2.3.1 擴增結(jié)果 成功獲得大小相符的基因片段，見圖5。大小分別約為2 550 bp、2 950 bp和2 400 bp。

2.3.2 克隆鑒定和測序 重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定顯示，將3個片段成功克隆到pMD19-T載體中。經(jīng)測序、拼接，獲得了FCV全基因組序列，序列全長7 687 nt。該序列GenBank登錄號為KX815169?；蚪M含有3個開放閱讀框，主要編碼3種蛋白：非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)。

圖5 FCV全基因組克隆

2.3.3 基因組序列同源性分析 將分離株FCV-YH/16全基因組與21株國內(nèi)外流行毒株、疫苗株進行序列分析比對，并構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，該毒株與疫苗株F4(D31836，日本)、F9(M86379，英國)、F65(AF109465，英國)和FCV2024(AF479590，德國)基因組同源性為76.3%～77.7%。與12Q087-1 (KJ572400，南韓，2012分離株)毒株同源性最高為80.5%，與疫苗株F9同源性最低為76.3%。該毒株與12Q087-1 (KJ572400，南韓)、 GD (GU214989)、SH (KP987265，長春)、FB-NJ-13在一個大的分支上，而與疫苗株F4、F9和F65等不在一個分支上(見圖6)。

圖6 FCV與其他毒株基因組進化分析

編碼非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1基因進行比對分析發(fā)現(xiàn)，ORF1相對保守，與21株國內(nèi)外代表毒株的氨基酸同源性分析顯示，同源性在85.8%～92.3%，遺傳進化樹顯示，該毒株與12Q087-1、 FB-NJ-13和SH等毒株在一個大的分支上，與疫苗株F4、F9等不在一個分支上(見圖7)。與12Q087-5毒株同源性最高為92.9%，與疫苗株F65同源性最低為85.8%。

編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1的 ORF2 基因變異較大。與21株國內(nèi)外代表毒株的氨基酸同源性分析顯示，同源性為82.6%～91.0%。該分離株與FB-NJ-13、GD和SH等在一個大的分支上，與疫苗株F4、F9等不在一個分支上(見圖7)。與GD分離株同源性最高為91%，與GX01-13分離株同源性最低為82.6%。分析結(jié)果顯示，本實驗室分離株不是疫苗株。編碼VP2蛋白的ORF3基因也相對保守，氨基酸同源性在86.8%～92.5%，其中與FB-NJ-13分離株同源性最高為92.5%。

圖7 非結(jié)構(gòu)蛋白(A)和結(jié)構(gòu)蛋白(B)氨基酸序列進化分析

3 討論

貓杯狀病毒是引起貓科動物出現(xiàn)急性或慢性呼吸道疾病的病原之一，主要感染貓，有時感染虎、獵豹、獅等[3,5-6]。主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病和結(jié)膜炎、發(fā)燒，有時動物也會表現(xiàn)不同的神經(jīng)癥狀甚至引起母體流產(chǎn)[7]?；⒏腥矩埍瓲畈《?傳染性鼻-結(jié)膜炎病毒)已有報道，一般癥狀不嚴重，因毒株的毒力和動物的抵抗力不同，癥狀有所差異。單獨感染FCV時，不引起成年動物致死性疾病，一旦混合其他疾病感染往往會增加病情，從而導(dǎo)致死亡率提高[3]。

本試驗從1例出現(xiàn)結(jié)膜炎、口腔炎等癥狀，并繼發(fā)其他疾病感染的病死東北虎中成功分離出1株貓杯狀病毒。其基因組全長7 687 nt，含有3個開放閱讀框。序列比對顯示，各毒株之間基因組同源性為76.3%～80.5%，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的ORF1區(qū)域，各毒株相對保守，氨基酸同源性為85.8%～92.3%；編碼核衣殼蛋白的ORF2區(qū)域，變異較大。序列分析顯示，除美國的F9毒株和UTCVM-NH2毒株在496～498位為DNN(NNN)外，其余各株在此位均缺失。另外發(fā)現(xiàn)與21株國內(nèi)外代表株、疫苗株相比，該毒株的VP1氨基酸序列發(fā)生了9處變異，分別為A433變成了S，A449變成了S，T(D/I)492變成了N， G(D/K/N)495變成了Q，G(D/N)508變成了S， D(G/N)510變成了S，T(S/Q)512變成了E， D(E)526變成了A，K(T/S)645變成了N。另外還發(fā)現(xiàn)5個區(qū)域的3個連續(xù)的氨基酸發(fā)生了變異組合，分別為AA398-400變?yōu)镼RE)，aa442-444變?yōu)锳NS，aa449-451變?yōu)镾SE，aa492-494變?yōu)镹LN，aa524-526變?yōu)镹QA，一處連續(xù)4個氨基酸發(fā)生了變異組合aa642-645變?yōu)镾IGN。鄭翠玲等[ 8]研究的CH-GD毒株與參考毒株相比有3個區(qū)域的3個連續(xù)的氨基酸發(fā)生的變異；而本試驗有5處發(fā)生變異，這些變異是否影響病毒毒力或者更易感染虎還需進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV最易發(fā)生變異的蛋白為VP1，VP1分6個區(qū)(A～F)，其中E區(qū)(約427～527 aa)是變異最大的區(qū)域，本試驗的變異情況也大多發(fā)生在E區(qū)，與之前的研究相符[8-9]?；蚪M和VP1蛋白基因遺傳進化分析顯示，本毒株不和疫苗株在一個分支上，而與一些致病性較強的變異株在一個分支上，故本次分離的FCV毒株屬于毒力較強的毒株。

目前FCV已有疫苗進行預(yù)防，由其引起的疾病時有發(fā)生，甚至一些大型貓科動物如老虎、獵豹等感染的報道。另外編碼核衣殼蛋白的ORF2變異較大，加上各種免疫壓力的影響，使得疫苗免疫效果不佳[10]。因此，加強FCV的流行病學(xué)調(diào)查、對分離毒株進行遺傳變異分析，為篩選新型疫苗候選毒株、開發(fā)基因型疫苗提供科學(xué)參考。