單鐵英，李偉，韓文華，李靜霞，毛希瑞

子宮內(nèi)膜纖維化或?qū)m腔粘連往往是由于多次進(jìn)行人工流產(chǎn)術(shù)引起。宮腔鏡下可見(jiàn)正常的子宮內(nèi)膜缺失，宮腔表面局部或全部被一層蒼白色組織覆蓋，子宮前后壁粘連在一起。臨床表現(xiàn)為患者月經(jīng)量少或缺如、不孕不育等。目前對(duì)于子宮內(nèi)膜組織纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可以促進(jìn)上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增多，是組織、器官纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1-3]。但目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TGF-β1對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞影響的報(bào)道，本研究體外培養(yǎng)源于人子宮內(nèi)膜組織的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelium cells，EECs)，探索其對(duì)人子宮內(nèi)上皮細(xì)胞的增殖和活性的影響，為宮腔粘連的防治提供指導(dǎo)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 正常人子宮內(nèi)膜組織： 收集2017年6月1日—12月1日在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院腹腔鏡下因子宮肌瘤而進(jìn)行子宮全切患者的病理標(biāo)本，病理結(jié)果為增生期子宮內(nèi)膜。患者年齡(40.0±2.6)歲，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有使用激素類藥物。取出的子宮內(nèi)膜組織，快速投入冰浴的培養(yǎng)液中，送往實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑： TGF-β1購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；角質(zhì)蛋白抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA) 和上皮性鈣黏附素(epithelial cadherin，E-cadherin)抗體均購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒、ELLSA試劑盒均購(gòu)自上海紀(jì)寧生物科研有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離原代人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞： 洗凈內(nèi)膜組織表面的血液，剪為細(xì)小碎塊；加入Ⅰ型膠原酶置于37℃溫箱中孵育40 min，100目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液以600 r/min 離心10 min，離心半徑為 6 cm，其沉淀用胎牛血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，留出少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測(cè)和鑒定；剩余細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，觀察活細(xì)胞以及HE染色后形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 噻唑藍(lán)法檢測(cè)TGF-β1對(duì)EECs增殖： 將培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮濃度為5×104個(gè)/ml，滴加到96孔板中，每孔為200 μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h，使其生長(zhǎng)同步化后分為2組：正常對(duì)照組和3個(gè)不同濃度TGF-β1組共4組。正常對(duì)照組：用細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；實(shí)驗(yàn)組：分別用濃度為2 ng/ml、5 ng/ml 和 10 ng/ml 的TGF-β1和細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵育1 d、2 d、3 d時(shí)；滴加濃度為5 mg/ml的噻唑藍(lán)20 μl/孔，作用4 h。吸出各孔的培養(yǎng)液，滴加二甲基亞砜150 μl/孔，搖晃10 min后于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光吸收值。根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 ELISA檢測(cè)EECs上清液中纖黏連蛋白(FN)和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)含量： 細(xì)胞分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，正常對(duì)照組: 用細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；實(shí)驗(yàn)組：用5 ng/ml 的TGF-β1和細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，吸取每組的培養(yǎng)液，仔細(xì)遵循ELISA試劑盒要求的步驟進(jìn)行操作，最后放在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)為450 nm處分別檢測(cè)各孔的A 值，計(jì)算出培養(yǎng)液中FN和Col-Ⅰ的含量。

1.2.4 免疫印跡法檢測(cè)EECs胞質(zhì)中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及鈣黏附蛋白-E (E-cadherin)的表達(dá)水平: 細(xì)胞分為4組，正常對(duì)照組：用細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；實(shí)驗(yàn)組：用2 ng/ml、5 ng/ml和10 ng/ml 的TGF-β1和細(xì)胞培養(yǎng)液孵育；孵育48 h后，分離每組細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，分別吸出50 μg并加入上樣緩沖液5×SDS均勻，100℃水浴 5 min，冰塊上5 min，滴加到SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)，在100 V恒壓下進(jìn)行電泳。然后把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，浸入封閉液(含有無(wú)脂奶粉的TTBS)中2 h。分別加入鼠抗人單克隆抗體α-SMA (1∶500)和E-cadherin (1∶500)溶液孵育，4 ℃過(guò)夜。將膜放入TTBS溶液5 min，取出后滴加二抗在室溫下作用2 h，將膜放入TTBS溶液5 min，顯色。利用免疫印跡分析儀定量分析區(qū)帶的信號(hào)強(qiáng)弱。

2 結(jié) 果

2.1 EECs的形態(tài)結(jié)構(gòu)與鑒定結(jié)果 細(xì)胞于倒置顯微鏡下可見(jiàn)，許多呈團(tuán)狀的剛分離的細(xì)胞，純度>93%，活性率為92%～96%，24 h常規(guī)培養(yǎng)后可貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞體積增大，采用HE染色可見(jiàn)：形態(tài)呈卵圓形，單個(gè)核，大而圓，居中，核染色淺，可見(jiàn)核仁，胞質(zhì)粉紅色，其中有散在的藍(lán)紫色顆粒。免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞： 細(xì)胞呈角質(zhì)蛋白染色可見(jiàn)胞質(zhì)中有棕黃色顆粒，圖1見(jiàn)封3。

2.2 TGF-β1促進(jìn)EECs的增殖比較 在第1天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)目與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在第2天和第3天時(shí)，TGF-β1各實(shí)驗(yàn)組EECs的增殖率呈濃度和時(shí)間依賴性，TGF-β1濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其細(xì)胞數(shù)量增加越顯著，與正常對(duì)照組相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3 TGF-β1促進(jìn)EECs中FN和Col Ⅰ的分泌比較 正常對(duì)照組與 5 ng/ml 的TGF-β1組細(xì)胞懸液中FN和Col-Ⅰ的分泌量檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的分泌量顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.4 TGF-β1對(duì)EECs胞質(zhì)中的α-SMA及E-cadherin表達(dá)水平的影響 免疫印跡法結(jié)果顯示：在不同濃度的TGF-β1組中，與正常對(duì)照組相比，隨著濃度逐漸增加，胞質(zhì)中表達(dá)E-cadherin的量逐漸減少，而表達(dá)α-SMA的量卻逐漸增多(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表2。

組 別nCol ⅠFN正常對(duì)照組60.570±0.0210.476±0.011TGF-β1組60.756±0.0390.742±0.037t值10.78416.974P值0.0000.000

注：1.正常對(duì)照組；2.TGF-β1(2 ng/ml)組; 3.TGF-β1(5 ng/ml)組; 4.TGF-β1(10 ng/ml)組

圖3 免疫印跡法顯示EECs胞質(zhì)中的E-cadherin及α-SMA的表達(dá)水平

3 討 論

結(jié)構(gòu)和功能正常的子宮內(nèi)膜組織具有重要的孕育胚胎的作用，子宮內(nèi)膜的厚度會(huì)在雌激素和孕激素的作用下，發(fā)生周期性的變化。子宮內(nèi)膜的組織結(jié)構(gòu)由上皮層和固有層構(gòu)成，上皮層是單層柱狀細(xì)胞，并向固有層伸入形成許多小的腺體，固有層為結(jié)締組織，內(nèi)含豐富的血管和形狀呈星狀的基質(zhì)細(xì)胞[4-5]。其顏色為紅色。但是子宮內(nèi)膜組織偏薄或者其結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，均會(huì)導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生，比較多見(jiàn)的為子宮內(nèi)膜組織纖維化。已經(jīng)發(fā)生纖維化的子宮內(nèi)膜組織在宮腔鏡下顯示：上述正常子宮內(nèi)膜組織缺如，即子宮內(nèi)膜組織中靠近子宮腔面的上皮細(xì)胞消失，只見(jiàn)大量的結(jié)締組織，宮腔質(zhì)地變硬，顏色呈白色[6-7]。

表2 TGF-β1對(duì)EECs胞質(zhì)中的E-cadherin及α-SMA的表達(dá)水平的影響

注：與正常對(duì)照組相比，aP<0.05,bP<0.01

探究子宮內(nèi)膜組織纖維化的發(fā)病機(jī)制：(1)組織中的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多并且其活性也增強(qiáng)，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積在組織中；(2)組織中的上皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件的刺激下發(fā)生轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為類似間質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì)，能合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分；(3)組織中一些細(xì)胞因子含量增多，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等，它們被稱為致纖維化的細(xì)胞因子，在多種組織的纖維化過(guò)程中扮演者重要角色。

TGF-β1在組織的纖維化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，研究表明它參與了多種器官和組織的纖維化過(guò)程[8-11]，它不僅可以促進(jìn)組織中的間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生分裂、數(shù)量增加，增強(qiáng)其合成和分泌功能，產(chǎn)生大量的結(jié)締組織成分，還可以使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其具有較強(qiáng)的分泌細(xì)胞外基質(zhì)的活性。已有研究顯示：在體外腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)后，可以向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞形態(tài)由典型的卵圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，并與周圍細(xì)胞分離，胞質(zhì)中合成α-SMA蛋白增多，而合成E-cadherin 降低[12]。

上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，是器官纖維化發(fā)生的重要基礎(chǔ)[13-17]。由于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在組織發(fā)生中與基質(zhì)細(xì)胞具有同源性，因此，在一定的病理?xiàng)l件下可發(fā)生子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N細(xì)胞即肌成纖維細(xì)胞，細(xì)胞胞質(zhì)中的E-cadherin含量降低，而α-SMA含量升高，可以穿越破裂的基底膜，進(jìn)入固有層。肌成纖維細(xì)胞的功能與結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞功能相比，它具有更強(qiáng)的分裂、增殖能力，并且有較強(qiáng)的合成和分泌結(jié)締組織中的基質(zhì)成分的能力。本研究結(jié)果顯示，在體外TGF-β1可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分裂、增殖；TGF-β1使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞合成α-SMA顯著增加(P<0.01)，而E-cadherin合成量明顯下降(P<0.01)，表明TGF-β1刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞；TGF-β1使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞懸液中Col-Ⅰ和FN的分泌量顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明TGF-β1能明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)FN和Col-Ⅰ分泌，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致。由此可知，TGF-β1可以通過(guò)使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞以達(dá)到促進(jìn)子宮內(nèi)膜纖維化的進(jìn)程。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

單鐵英、李偉：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)；韓文華：實(shí)施研究過(guò)程，論文審核;李靜霞：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，資料搜集整理，論文修改;毛希瑞：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析