劉 艷 黃傳書 吳 均 趙 珮 雷 霆 邢康康

(1.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

桑黃(Phellinusbaumii)是一類珍貴的藥用真菌，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomyeotina)、層菌綱(Hymenomyeetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaeeae)、針層孔菌屬(Phellinus)，主要寄生于桑樹、楊樹、樺樹等闊葉樹的樹干、樹樁或倒木上[1]。桑黃含有多糖、黃酮和三萜等多種活性物質(zhì)，具有抗癌、抗腫瘤、保肝、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用[2-5]。近年來，研究表明桑黃多糖能顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，對人體不良反應(yīng)小，被國際公認(rèn)為使用免疫療法生物治癌領(lǐng)域中效率最高的真菌，其突出的抗腫瘤功效在日、韓等國備受關(guān)注，已成為國內(nèi)外醫(yī)藥制劑與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的熱點(diǎn)，具有廣闊的市場前景[6]。由于桑黃生長需要較為特殊的自然氣候環(huán)境，且生長周期長，因而野生桑黃數(shù)量非常稀少[6]，人工栽培桑黃十分重要。目前，人工栽培桑黃方式有代料栽培和段木栽培[7]。本試驗(yàn)擬優(yōu)化桑黃代料栽培的條件，為縮短桑黃栽培周期，提高桑黃產(chǎn)量和品質(zhì)，提供一定的參考，為桑黃規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 桑黃菌種

桑黃菌種為鮑氏針層孔菌(Phellinusbaumii)，來源于安徽金寨尚臻生物科技有限公司。桑黃原種的菌塊緊實(shí)，呈現(xiàn)白黃色。

1.1.2 桑木屑

老桑樹木屑用重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院30年生青皮湖桑桑樹主干粉碎，嫩桑枝木屑用重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院青皮湖桑夏伐枝條粉碎。

1.2.3 其他輔助材料

全部從市場購買。

1.2 方法

1.2.1 適宜代料配方的篩選

參考現(xiàn)有食用菌生產(chǎn)代料配方，結(jié)合前期研究結(jié)果，以桑枝木屑為主要原料，稻殼、棉籽殼、玉米粉、麥麩等為輔料，進(jìn)行不同配料組分比較試驗(yàn)研究，以桑黃總產(chǎn)量、平均產(chǎn)量、菌株成活率、生長速度(以菌絲長滿菌袋時(shí)間計(jì)算)為衡量指標(biāo)，篩選適合桑樹桑黃栽培的代料配方，不同配料組分設(shè)計(jì)詳見表1。

表1 不同配料組分設(shè)計(jì)

1.2.2 接種方法的優(yōu)化

采用5種不同接種方法，每種方法設(shè)置5個(gè)平行，在相同培養(yǎng)條件下，通過調(diào)查雜菌感染率、菌絲生長整齊度及生長速度(以菌絲長滿菌袋的時(shí)間計(jì)算)，篩選最佳接種方法。

(1)將2塊(每塊體積為12 cm3～16 cm3)長滿菌絲的原種，接種到代料中。

(2)取自制發(fā)酵液體菌種(菌液濃度為1010cfu/mL)15 mL，接種到代料中。

(3)將菌絲長滿平皿(規(guī)格：90 mm)的整塊菌種(連帶著培養(yǎng)基)，接種到代料中。

(4)將長滿菌絲的整塊培養(yǎng)基(規(guī)格：90 mm)，平分成2塊，分別接種到代料中。

(5)取自制固液混合發(fā)酵的菌種15 mL，接種到代料中。

1.2.3 菌絲生長條件的優(yōu)化

以前期篩選的適宜桑黃代料配方，以菌絲生長速度(以菌絲長滿菌袋的時(shí)間計(jì)算)為衡量指標(biāo)，進(jìn)一步研究適宜菌絲生長的溫度和濕度。

(1)溫度：在避光及其它培養(yǎng)條件一致的情況下，按20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃梯度分別處理，每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行，調(diào)查不同溫度對菌絲生長速度的影響，篩選適宜的培養(yǎng)溫度。

(2)濕度：在避光及其它培養(yǎng)條件一致的情況下，按相對濕度(RH)55%、65%、75%、85%梯度分別處理，每個(gè)濕度梯度設(shè)置3個(gè)平行，調(diào)查不同濕度對菌絲生長速度的影響，篩選適宜的培養(yǎng)濕度。

1.2.4 子實(shí)體生長條件的優(yōu)化

以前期研究的適宜桑黃代料配方，在300 Lx的散射光條件下，其它培養(yǎng)條件一致，以子實(shí)體產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，進(jìn)一步研究適宜子實(shí)體生長的溫度和濕度。

①溫度

按23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃溫度梯度分別處理，每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行，采用相同濕度及處理方法，調(diào)查不同溫度對子實(shí)體生長的影響，篩選適宜子實(shí)體生長的培養(yǎng)溫度。

②濕度

按65%、75%、85%、95%濕度梯度分別處理，每個(gè)濕度梯度設(shè)置3個(gè)平行，采用相同溫度及處理方法，調(diào)查不同濕度對子實(shí)體生長的影響，篩選適宜子實(shí)體生長的培養(yǎng)濕度。

1.2.5 室外栽培防雜菌方法

參考目前常用的消毒滅菌方法，在大棚中分別采用福爾馬林消毒法[8-9]、雙氧水消毒法[8]和二氯異氰尿酸鈉煙熏法進(jìn)行環(huán)境消毒比較試驗(yàn)，在消毒處理的第2 d，用PDA培養(yǎng)基的平板和含桑黃菌的平板置于大棚內(nèi)，4 d后調(diào)查雜菌感染程度、微生物種類和桑黃菌的存活率，篩選最佳消毒方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化代料配方的分析

通過9組不同配料組分的對比試驗(yàn)，結(jié)果表明配方1～4均含老桑樹木屑，其中配方1桑黃菌絲長滿袋時(shí)間最短，總產(chǎn)量和平均產(chǎn)量均高于其它組；配方5含嫩桑枝木屑，在木屑菌袋中產(chǎn)量最低、菌絲長滿菌袋時(shí)間最長；配方6～9均無桑枝木屑，全部未成活。桑黃菌屬于木腐菌，老桑樹木屑的木質(zhì)化程度高，其它養(yǎng)分較嫩桑枝木屑更加豐富，為桑黃菌的生長提供了豐富的纖維素和木質(zhì)素。適量的稻殼和棉籽殼，不僅含有較多的纖維素和木質(zhì)素，同時(shí)吸水能力強(qiáng)，通氣性較好。配方2中菌絲長滿袋的時(shí)間，總產(chǎn)量和平均產(chǎn)量僅次于配方1，可能是因?yàn)榕浞?中桑枝木屑含量比配方1少2%，熟石膏含量卻比配方1多2%，較強(qiáng)的堿性環(huán)境，雖然可以抑制雜菌的生長，但是在一定程度上也抑制了桑黃菌絲的生長。配方3與配方5對比，嫩桑枝木屑也可以用于培養(yǎng)桑黃菌，但是產(chǎn)量和平均產(chǎn)量較低。配方6～9全部染雜菌，可能是因?yàn)橛衩追鄣矸酆扛?，易染雜菌；稻殼和棉籽殼的通氣性高，導(dǎo)致菌袋不緊實(shí)，不接近樹木的木質(zhì)部和韌皮部的緊實(shí)感，桑黃菌不適應(yīng)。此外，配方6～9不含桑樹木屑，纖維素和木質(zhì)素含量低，桑黃菌絲生長速率慢，未形成菌種優(yōu)勢(表2)。

表2 不同配料組分試驗(yàn)結(jié)果

綜合分析，桑樹木屑、桑枝木屑均可作為桑黃代料栽培的主要原料，老桑樹木屑比嫩桑枝木屑效果好，尤以配方1最佳。

2.2 優(yōu)化接種方式的分析

方法1和方法2相比，前者固體菌種接種，每個(gè)菌袋中的菌絲生長整齊性差，長滿菌袋的平均時(shí)間最長；后者液體菌種接種能控制接種量，保證接種量相同，使得研究結(jié)果具有嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性，但是由于微生物更易利用液體中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，導(dǎo)致培養(yǎng)前期易染雜菌。方法3，長滿培養(yǎng)基的整塊菌落接種，桑黃菌數(shù)量多，可較快形成菌種優(yōu)勢，抑制雜菌的生長，達(dá)到以菌治菌的生物防控效果，且生長整齊性好，長滿菌袋的時(shí)間最短。固液混合接種方式很難保證接種量的一致性，同時(shí)液體菌種容易染菌(表3)。

表3 不同接種方式的篩選結(jié)果

注：*表示菌絲生長整齊度，*越多表示越整齊。*：整齊性差，**整齊性較好，***整齊性好。

綜合分析，上述5種方式均可用于桑黃栽培的接種，接種方式較好的是長滿培養(yǎng)基的整塊菌落接種。

2.3 優(yōu)化菌絲生長條件的分析

2.3.1 溫度

在培養(yǎng)濕度為68%，避光及其它培養(yǎng)條件一致的情況下，不同培養(yǎng)溫度對桑黃菌生長情況的影響見圖1。溫度低于25 ℃或高于30 ℃時(shí)，桑黃菌長滿菌袋的時(shí)間較長，生長速率較慢。當(dāng)溫度處于25 ℃～30 ℃時(shí)，桑黃菌長滿菌袋的時(shí)間較短，生長良好。

2.3.2 濕度

在培養(yǎng)溫度為25 ℃，避光及其它培養(yǎng)條件一致的情況下，不同培養(yǎng)濕度對桑黃菌生長情況的影響見圖2。濕度低于65%或高于75%時(shí)，桑黃菌長滿菌袋的時(shí)間較長，生長速率較慢。當(dāng)濕度處于65%～75%時(shí)，桑黃菌長滿菌袋的時(shí)間較短，生長良好。

圖1 不同溫度對桑黃菌生長情況的影響

圖2 不同濕度對桑黃菌生長情況的影響

2.4 優(yōu)化子實(shí)體生長條件的分析

2.4.1 溫度

在適宜營養(yǎng)條件(適宜的代料配方)和適宜環(huán)境條件(溫度25 ℃，濕度68%)下，進(jìn)行桑黃菌絲培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長滿菌袋，在深褐色部位開月牙口(長2 cm，寬1 cm)后，進(jìn)入桑黃子實(shí)體培養(yǎng)階段，不同溫度對桑黃產(chǎn)量的影響見圖3。溫度低于26 ℃或高于29 ℃時(shí)，桑黃菌產(chǎn)量較低，且影響桑黃的正常生長。當(dāng)溫度處于26 ℃～29 ℃時(shí)，桑黃菌產(chǎn)量較高，桑黃生長良好。

2.4.2 濕度

在適宜營養(yǎng)條件(適宜的代料配方)和適宜環(huán)境條件(溫度25 ℃，濕度68%)下，進(jìn)行桑黃菌絲培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長滿菌袋，在深褐色部位開月牙口(長2 cm，寬1 cm)后，進(jìn)入桑黃子實(shí)體培養(yǎng)階段，不同濕度對桑黃產(chǎn)量的影響見圖4。濕度低于85%時(shí)，桑黃菌產(chǎn)量較低，且影響桑黃的正常生長。當(dāng)濕度處于85%～95%時(shí)，桑黃菌產(chǎn)量較高，桑黃生長良好。

圖3 不同溫度對桑黃子實(shí)體產(chǎn)量的影響

圖4 不同濕度對桑黃子實(shí)體產(chǎn)量的影響

2.5 不同消毒方法的分析

大棚中分別采用福爾馬林消毒法、雙氧水消毒法和消毒劑煙熏法進(jìn)行消毒，滅菌效果見表4。煙熏消毒法，雖消毒范圍廣，但是消毒效果較差，PDA培養(yǎng)基長出細(xì)菌、青霉菌及鏈孢霉，桑黃菌存活率低。雙氧水消毒法，可防治細(xì)菌和青霉菌，但不能殺滅鏈孢霉，且桑黃菌存活率低。福爾馬林消毒法，PDA培養(yǎng)基沒有出現(xiàn)染菌，說明空氣中微生物含量極低，滅菌較徹底，且桑黃菌正常生長，適合用于大棚栽培桑黃前的消毒滅菌。

表4 不同消毒方法的效果

注：*表示培養(yǎng)基感染雜菌程度，*越多感染雜菌越重。**：染菌程度較大，****：染菌程度大。

3 討論

本研究針對目前桑黃代料栽培菌絲生長速度慢、長勢不一致、栽培環(huán)境消毒不徹底、桑黃產(chǎn)量低等問題，從代料配方、接種方式、桑黃培養(yǎng)條件和栽培大棚消毒方法等方面進(jìn)行了優(yōu)化研究。篩選出了適宜的桑黃代料栽培配方即老桑樹木屑78%、玉米粉2%、稻殼2%、棉籽殼17%、熟石膏1%；適合菌絲生長溫度為25 ℃～30 ℃、濕度為65%～75%；適宜子實(shí)體生長溫度為26 ℃～29 ℃、濕度為85%～95%；以長滿培養(yǎng)基的整塊菌落接種方式效果較好；用福爾馬林消毒大棚效果較好。

本研究發(fā)現(xiàn)除老桑樹及椴木可用于桑黃栽培外，嫩桑枝木屑也可用于桑黃的栽培，為桑黃的培養(yǎng)提供新原料，為桑枝廢棄物的利用提供一個(gè)新途徑，但以嫩桑枝為主要代料栽培桑黃較老桑樹木屑及椴木效果差，本研究未對其它適宜桑黃代料栽培樹種作研究。老、嫩桑樹木屑代料栽培桑黃效果差異原因及解決辦法、適宜桑黃代料栽培的其它樹種及配套技術(shù)等有待進(jìn)一步研究。