袁琴琴

(菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東菏澤 274000)

銀線草(Chloranthus japonicusSieb．)為金粟蘭科金粟蘭屬多年生的草本植物，以根或者全草入藥，具有消炎止痛、解蛇毒等功效，在民間應(yīng)用廣泛［1－2］。銀線草中的酚酸類和香豆素在其主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，酚類成分和香豆素類成分具有良好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗激素、抗血栓、抗變態(tài)反應(yīng)等活性［3－6］。由于它們特殊的生理作用，研究酚類和香豆素類化合物具有十分重要的意義。目前，單體化合物提取比較困難，本研究通過液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)銀線草中的主要成分進(jìn)行質(zhì)普檢測(cè)，根據(jù)各個(gè)色譜的ESI質(zhì)譜信息和色譜圖中主要峰的出峰時(shí)間以及各化學(xué)成分的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合前人的文獻(xiàn)對(duì)迷迭香酸、反丁烯二酸、異秦皮啶、綠原酸進(jìn)行了初步表征。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

銀線草樣品于2010年7月底采集于陜西省太白山，經(jīng)生命科學(xué)院田先華教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物銀線草(Chloranthus japonicusSieb．)。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇(美國(guó)Fisher公司，色譜純);甲酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純);所用水均為超純水;標(biāo)準(zhǔn)品:迷迭香酸(批號(hào):07902PH)，異秦皮啶(批號(hào):110837－200707)，反丁烯二酸(批號(hào):11154－200001)，綠原酸(批號(hào):110753200413)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1．3 實(shí)驗(yàn)儀器

LC2010 AHT HPLC(日本SHIMADZU島津公司);SL202N型電子秤(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);MILLI－Q超純水儀器(MILLIPORE公司);RE250AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器公司);KQ5200超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);色譜柱 Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美國(guó)Phenomenex公司);SL202N型電子秤(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);色譜柱Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美國(guó) Phenomenex公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

適量精密稱取反丁烯二酸、異秦皮啶、綠原酸和迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配置混合標(biāo)品，溶液須經(jīng)0．22μm有機(jī)相濾膜過濾。

2．2 銀線草溶液制備

太白山地點(diǎn)的銀線草粉末1 g，加5 mL的70%甲醇超聲提取30 min兩次，合并提取液，搖勻，用0．22 m微孔濾膜濾過，即得銀線草樣品溶液。

2．3 實(shí)驗(yàn)方法

2．3．1 色譜條件

色譜柱采用 Phenomenex C18(250 mm ×4．6 mm，5μm)流動(dòng)相:A磷酸水，B甲醇:脫條件條件:0～5 min，甲醇15% ～25%;5～20 min，甲醇 25% ～30%;20～45 min，甲醇 30% ～40%;45 ～95min，甲醇40% ～60%。B;流速0．8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm;柱溫25℃;記錄時(shí)間95 min;進(jìn)樣量10μL。

2．3．2 質(zhì)譜條件

干燥氣流速4 L/min，干燥氣溫度180℃，電噴霧離子化(ESI)，負(fù)離子方式檢測(cè)，Auto MSn，掃描范圍50～1000 m/z。

3 結(jié)果分析

通過樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰的MS數(shù)據(jù)和出峰時(shí)間以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較分析，初步鑒定出4個(gè)化合物。

1號(hào)峰。銀線草樣品和反丁烯二酸標(biāo)品的HPLC出峰時(shí)間均為6．5 min(圖3);銀線草樣品溶液在6．5 min一級(jí)質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z與反丁烯二酸標(biāo)品的ESI質(zhì)譜圖得到的信息一致，均為115(圖1、2)。根據(jù)以上信息，初步推斷該物質(zhì)反丁烯二酸，相對(duì)分子質(zhì)量為116?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖4。

2號(hào)峰。銀線草樣品和綠原酸標(biāo)品的HPLC出峰時(shí)間均為15．9 min(圖3)，銀線草樣品溶液在15．9 min一級(jí)質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z與綠原酸標(biāo)品的ESI質(zhì)譜圖顯示的信息一致，m/z均為353(圖1、2)，根據(jù)以上信息，初步推斷該物質(zhì)為綠原酸，相對(duì)分子質(zhì)量為354，首次發(fā)現(xiàn)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的ESI質(zhì)譜圖Fig．1 TIC spectrum of standard compounds

圖2 銀線草樣品的ESI質(zhì)譜圖Fig．2 TIC spectrum of Chloranthus japonicus Sieb

圖3 標(biāo)品的HPLCFig．3 HPLC of standard compounds

3號(hào)峰。異秦皮啶標(biāo)品出峰時(shí)間為29．8 min(圖3)，銀線草樣品在同樣時(shí)間出峰，銀線草樣品溶液在29．9 min一級(jí)質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z為353，而異秦皮啶ESI質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子的m/z卻為221(圖1、2)，綜合該物質(zhì)的HPLC出峰時(shí)間和ESI質(zhì)譜信息，初步推斷該物質(zhì)為異嗪皮啶，相對(duì)分子質(zhì)量為222，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

4號(hào)峰。迷迭香酸標(biāo)品出峰時(shí)間為58．3 min(圖3)，銀線草樣品在同樣時(shí)間出峰，迷迭香酸ESI質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子［M－H］－的m/z為359(圖1、2)，銀線草樣品溶液一級(jí)質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z為359，綜合該物質(zhì)的HPLC出峰時(shí)間和ESI質(zhì)譜信息，初步推斷該物質(zhì)為迷迭香酸，相對(duì)分子質(zhì)量為360，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 化學(xué)式Fig．4 Chemical formula

4 結(jié)論

質(zhì)譜技術(shù)是鑒定化合物的一種手段，具有高選擇性和高靈敏的優(yōu)點(diǎn)，而液相質(zhì)譜技術(shù)融合了具有高效的分離能力的高效液相方法以及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜方法。這種技術(shù)不但彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)的不足，還可以提供化學(xué)成分的信息，在未知化合物結(jié)構(gòu)的探索上和新藥的研究及開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜技術(shù)根據(jù)其出峰時(shí)間和ESI質(zhì)譜信息，初步確定銀線草中含有反丁烯二酸，異嗪皮啶、綠原酸和迷迭香酸。為全面分析其活性成分和銀線草藥材的質(zhì)量考察指標(biāo)提供資料