劉曉芳，梁惠珍，閆江娜，李 婷

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中 030619)

甘姜苓術(shù)湯原名腎著湯，出自《金匱要略。五臟風(fēng)寒積聚病脈證并治第十一》［2］，該方由四味藥材組成，分別為甘草、干姜、茯苓、白術(shù)。在《金匱要略》中用來治療腎著病，臨床表現(xiàn)為“身體重，腰中冷，如坐水中，反不渴，小便不利，飲食如故，．．．．．．．腰以下冷痛，腹重如帶五千錢［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明此方在治療慢性盆腔疼痛等方面具有顯著療效［4］。此方中有大量的多糖類成分，近年來植物多糖藥理作用研究進(jìn)展表明多糖在抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抗炎、抗?jié)?、降血糖、降血脂、抗凝血及提高免疫功能等方面有顯著的作用［5］。該實(shí)驗(yàn)中首先根據(jù)單味藥材提取多糖的方法，采取正交試驗(yàn)法確定多糖的最佳提取工藝，結(jié)合苯酚－硫酸法顯色，用紫外可見分光光度法測(cè)定甘姜苓術(shù)湯中多糖的含量。

1 材料

1．1 儀器

FA224電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，TU－1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，SHZ－D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，冰箱(合肥美菱股份有限公司。

1．2 試劑與藥材

濃硫酸(分析純)，苯酚(分析純，批號(hào):20160516)，葡萄糖(分析純，批號(hào):20110214)，95% 乙醇(分析純，批號(hào):20150206)，干姜(安徽謂博中藥飲片有限公司 批號(hào):180101)，茯苓(安徽謂博中藥飲片有限公司，批號(hào):180101)，甘草(安徽精誠本草中藥飲片有限公司，批號(hào):171001)，白術(shù)(安徽精誠本草中藥飲片有限公司，批號(hào):171001)

2 方法與結(jié)果

2．1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．1．1 對(duì)照品溶液的制備

稱取于104℃下烘至恒重的無水葡萄糖25．3 mg，精密稱定，放置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度定容，搖勻，從中吸取8 mL置于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度定容，搖勻，制得0．0810 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2．1．2 供試品溶液的制備

依據(jù)處方稱取藥材(甘草6 g，干姜12 g，茯苓12 g，白術(shù)6 g)，精密稱取，參照本實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取條件，加入12倍量的水，煎煮30 min，煎煮三次，完成后，經(jīng)紗布和棉花過濾，合并濾液，濃縮至50 mL，冷卻至室溫，加入95%乙醇使其含醇量達(dá)到80%，放入冰箱中冷藏24 h，抽濾。每次用80%乙醇10 mL洗滌殘?jiān)?，共兩次。將所得濾餅在54℃下的烘箱中烘至恒重。精密稱取0．1 g干燥樣品，放于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度定容，從中吸取3 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度定容，搖勻，即可得到供試品溶液。

2．1．3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液1．0 mL，放于10 m L試管中，用移液管精密吸取1．0 mL蒸餾水加入到試管中使其補(bǔ)至2 mL，再精密吸取1．0 m L 5%的苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，搖勻，立即精密加入5．0 mL的濃硫酸 ，搖勻，沸水浴20 min［6］水浴完成后將其取出放置冷卻到室溫，配制相應(yīng)的試劑作為空白，在350～700 nm［7］波長(zhǎng)范圍下進(jìn)行掃描，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在490 nm處均有最大吸收峰，故確定490 nm為方中多糖的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)

2．1．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液 0．2、0．6、0．8、1．0、1．4 mL，將其分別置于10 mL試管中，分別用移液管精密吸取蒸餾水使其補(bǔ)至2 mL，再精密吸取1．0 mL5%的苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)加入試管中，搖勻，立即精密吸取濃硫酸5．0 mL加入到試管中，搖勻，配制相應(yīng)試劑作為空白，將6支試管沸水浴20min，水浴后將試管取出，放置冷卻到室溫，用紫外可見分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，得到吸光度分別為 0．068、0．279、0．380、0．487、0．709，以對(duì)照品溶液的濃度為x軸，以吸光度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖1可見，得到回歸方程 y=52．674x－0．0418(r=0．9998)，由此可得到葡萄糖溶液濃度在 0．002024 ～0．014168 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2．2 最佳提取條件選擇

2．2．1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考有關(guān)文獻(xiàn)［8－9］，選擇料液比為(A)、煎煮時(shí)間為(B)、煎煮次數(shù)(D)為因素，選用L9(34)為正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以原藥材中總多糖的含量作為指標(biāo)，確定最佳提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2．2．2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表

分析可得，表2中，影響甘姜苓術(shù)湯中總多糖的提取率的因素主要是D，將C為誤差進(jìn)行方差分析，表3可見，顯示結(jié)果為ɑ=0．10時(shí)，D對(duì)甘姜苓術(shù)湯中總多糖的提取具有很明顯的影響，而A和B兩個(gè)因素則沒有顯著影響，我們選擇最佳的提取條件為A1B1D3，結(jié)果為煎煮次數(shù)為3次，煎煮時(shí)間為30 min，加入水量為12倍的藥材量。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2．3 方法學(xué)考察試驗(yàn)

2．3．1 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取1．0 mL葡萄糖對(duì)照品溶液6份，依據(jù)2．1．3項(xiàng)下的方法測(cè)吸光度，測(cè)得吸光度分別為 0．478、0．477、0．454、0．468、0．437、0．467，計(jì)算可得 RSD 為1．86%(n=6)，由此可說明該方法的精密度較好。

2．3．2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取于54℃下烘至恒重的干燥樣品0．1 g，稱取6份(0．1000、0．1014、0．1020、0．1013、0．1012、0．1008 g)，分別放于50 mL的容量瓶中定容至刻度，再從中精密吸取1．0 mL于10 m L的容量瓶中定容至刻度，搖勻，精密吸取0．5 mL溶液分別放于試管中，依據(jù)2．1．3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，吸光度依次為0．322、0．324、0．340、0．331、0．349、0．336，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品中總多糖的含量，計(jì)算得樣品中總多糖的含量依次為552．53、547．90、568．50、558．93、586．50 mg/g，求得平均含量為 563．93 mg/g，RSD為2．30%，由此可得出此方法的重復(fù)性較好。

2．3．3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1．0 m L的供試品溶液，依據(jù)2．1．3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，在13、28、42、60、85、120 min 進(jìn)行測(cè)定，得到吸光度分別為 0．505、0．483、0．506、0．507、0．513、0．456，計(jì)算得 RSD為4．38%(n=6)，由此可說明該方法下供試品顯色后至少兩小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2．3．4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取于54℃下烘至恒重的干燥樣品0．05 g，平行取六份，分別為(0．0507、0．0500、0．0509、0．0504、0．0509、0．505 g)，再精密稱取葡萄糖0．027 g，將稱取的樣品和葡萄糖放入50 mL容量瓶中定容至刻度，從中精密吸取1．0 mL于10 mL容量瓶中定容，搖勻，各精密吸取0．5 m L，依據(jù)2．1．3項(xiàng)下的方法測(cè)定其吸光度，吸光度分別為 0．312、0．320、0．330、0．319、0．316?？梢杂?jì)算出回收率，見表4，從表4中可見平均回收率為99．89%，RSD=3．18%。表明本實(shí)驗(yàn)確定的多糖提取工藝回收率高、準(zhǔn) 確性較好。

表4 甘姜苓術(shù)湯中總多糖的加樣回收率試驗(yàn)

2．4 樣品含量測(cè)定

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的此方中多糖的最佳提取工藝，進(jìn)行供試品的制備，根據(jù)2．1．2項(xiàng)下的方法平行制備三份供試品溶液，分別精密吸取1．0 mL溶液，制備相應(yīng)的空白試劑，按2．1．3方法在490 nm 下測(cè)定吸光度，含量分別為 42．11、43．52、45．48 mg/g，生藥材中總多糖的平均含量為43．70 mg/g。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用苯酚－硫酸法測(cè)定甘姜苓術(shù)湯中總多糖的含量，以葡糖糖溶液作為對(duì)照品，在波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定其吸光度，將數(shù)據(jù)代入回歸方程中可求得總多糖的含量。葡萄糖溶液濃度在0．002024～0．014168 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有較好的線性關(guān)系，平均回收率為99．89%，RSD=3．18%，生藥材中總多糖的平均含量為43．70 mg/g，該方法易于操作，且靈敏度較高，線性范圍較寬，有很好的重復(fù)性，因此可用于甘姜苓術(shù)湯總多糖的含量測(cè)定。