朱雪飛

(江蘇省揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚(yáng)州 225000)

千柏鼻炎膠囊收載于《中國藥典》2015版一部，由千里光、卷柏、羌活、決明子、麻黃、川芎、白芷7味制成，具有清熱解毒，活血祛風(fēng)，宣肺通竅之功效，臨床主要用于風(fēng)熱犯肺、內(nèi)郁化火、凝滯氣血所致的鼻塞、鼻癢氣熱、流涕黃稠，或持續(xù)鼻塞、嗅覺遲鈍；急慢性鼻炎、急慢性鼻竇炎見上述證候者[1]。千里光為菊科植物千里光SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地方部分，具有清熱解毒，明目，利濕的功效[2]。金絲桃苷是千里光中的指標(biāo)性成分[3]，也是千柏鼻炎膠囊中的主要藥效成分之一[4]。金絲桃苷具有抗肝腎損傷、抗抑郁、抗炎癥、抗癌、抗氧化應(yīng)激與抗細(xì)胞凋亡等藥理作用[5-9]。關(guān)于千里光提取物及其復(fù)方制劑中金絲桃苷的藥動學(xué)差異的比較尚未見報道，本研究為了考察復(fù)方中金絲桃苷的體內(nèi)過程是否受中藥配伍的影響，考察了大鼠灌胃千里光提取物和千柏鼻炎膠囊后的藥動學(xué)特征，初步評價復(fù)方中其他中藥配伍對金絲桃苷藥動學(xué)特征的影響，以揭示中藥復(fù)方配伍的合理性。

1 材料

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測器)；N2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；快速混勻器(江蘇金壇儀器廠)；島津AUW220D分析天平(島津)；微量移液器(美國Thermo公司)；BuchiR旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇儀器廠)；冷凍干燥機(jī)(德國Marin Christ公司)。金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201205)；千里光提取物(自制，HPLC法測得金絲桃苷含量為0.8312 mg·g-1)；千柏鼻炎膠囊(廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z44022415，批號：160707，HPLC法測定金絲桃苷含量為0.7135 mg·g-1)；乙腈(色譜純，美國TEDIA)；純凈水(自制)。清潔級SD雄性大鼠(揚(yáng)州大學(xué)動物實驗中心提供)，體重250 g左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.2%醋酸水溶液(14∶86)；檢測波長：360 nm；流速：1mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

2.2 千里光提取物的制備(同千柏鼻炎膠囊的制備工藝)

稱取千里光藥材適量，加10倍量水煎煮2次，第一次3h，第二次1.5h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至適量，真空干燥后即得。經(jīng)HPLC法測得金絲桃苷的含量為0.8312 mg·g-1。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取金絲桃苷對照品適量，加乙腈醇制成每1mL含0.1364 mg的溶液，即得。

2.4 血漿樣品的預(yù)處理

精密吸取血漿0.1mL，加0.2mL乙腈沉淀蛋白，渦流振蕩1min，12000r·min-1高速離心5min，取上清0.45μm微孔濾膜濾過，20μL進(jìn)樣。

2.5 藥動學(xué)研究

將SD雄性大鼠12只隨機(jī)分成2組，每組6只，給藥前禁食18h，自由飲水，將千里光提取物和千柏鼻炎膠囊(內(nèi)容物)分別用1%CMC-Na分散，分別灌胃給藥，給藥劑量按金絲桃苷折算均為10 mg·kg-1，并于給藥后給藥前和給藥后0.083，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h眼眶后靜脈叢取血，置肝素化的EP管中，分離血漿待預(yù)處理后測定。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用DAS2.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，血漿中金絲桃苷的峰濃度Cmax及達(dá)峰時間Tmax由實測數(shù)據(jù)直接得出。

3 結(jié)果

3.1 方法的專屬性

空白血漿、空白血漿中加入金絲桃苷對照品、灌胃千里光提取物及灌胃千柏鼻炎膠囊的血漿樣品色譜圖見圖1。由圖可見，金絲桃苷與其他內(nèi)源性成分分離效果良好，無干擾。

A.空白血漿；B.血漿中加入金絲桃苷對照品；C.灌胃千里光提取物后的血漿樣品；D.灌胃千柏鼻炎膠囊后的血漿樣品；1為金絲桃苷

圖1 大鼠血漿樣品中金絲桃苷的HPLC色譜圖

3.2 線性范圍及檢測限

精密吸取金絲桃苷對照品溶液適量，置于1mL離心管中，加入大鼠空白血漿100μL，配制成金絲桃苷濃度分別為0.341，0.682，1.364，3.410，6.820，13.640 μg·mL-1的血漿樣品，按2.4項下方法操作，進(jìn)樣分析，以峰面積(Y)對血藥濃度(X)進(jìn)行線性回歸得Y=81.013X+1257(r=0.9998)(n=6)，血漿中金絲桃苷在0.341～13.64 μg·mL-1之間線性關(guān)系良好，血漿中金絲桃苷檢測限為0.079 μg·mL-1。

3.3 準(zhǔn)確度實驗

精密吸取100μL空白血漿置于1mL離心管中，18份，分3組，精密加入不同量的金絲桃苷對照品，使分別為1.364，3.410，6.820 μg·mL-1的低、中、高濃度樣品，按 2.4項下方法操作，測定金絲桃苷含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 金絲桃苷回收率實驗(n=6,x±s)

3.4 精密度實驗

分別取金絲桃苷濃度為1.364，3.410，6.820 μg·mL-1的3種質(zhì)量濃度的血漿樣品在2.5項下的色譜條件下于日內(nèi)和日間各測定5次，計算日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見表2。

表2 金絲桃苷精密度實驗(n=6,x±s)

3.5 提取回收率

取上述的金絲桃苷濃度為1.364，3.410，6.820 μg·mL-1的血漿樣品(n = 6) ，按2.4項下方法處理，測定得到峰面積平均值A(chǔ)1；另取大鼠空白血漿100 μL，除不加對照品溶液，其他操作同“2.4”，向上清液中加入適量的金絲桃苷對照品溶液，使其濃度也分別為1.364，3.410，6.820 μg·mL-1的樣品，測定得到峰面積平均值A(chǔ)2，計算得低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿樣品中山奈酚的提取回收率(R=A1/A2×100%)。結(jié)果為3個濃度的提取回收率分別為87.2%，89.3%，90.5%，其RSD分別為3.52%，2.79%，2.43%。

3.6 穩(wěn)定性實驗

分別考察了灌胃給藥后大鼠血漿樣本在室溫、預(yù)處理后、反復(fù)凍融及長期冷凍條件下金絲桃苷的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，樣本室溫放置24h、預(yù)處理后樣品室內(nèi)(4℃)放置3d、反復(fù)凍融3次及-20℃冷凍儲藏1月均有良好穩(wěn)定性。

3.7 藥動學(xué)參數(shù)

用DAS2.0藥動學(xué)軟件對測得的血藥濃度數(shù)據(jù)擬合計算，結(jié)果表明千里光提取物和千柏鼻炎膠囊中的金絲桃苷在大鼠體內(nèi)的藥動過程均符合2房室模型，主要的藥動學(xué)參數(shù)見表3，其平均藥-時曲線見圖2。

圖2 金絲桃苷在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線(-◆-千柏鼻炎膠囊灌胃；-▲-千里光提取物灌胃)表3 金絲桃苷在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)

參數(shù)千柏鼻炎膠囊千里光提取物t1/2β/h68.573±20.1969.315±17.54t1/2Ka/h5.105±0.892#1.150±0.273AUC0→t/(μg·h·mL-1)0.008±0.0030.006±0.003AUC0→∞/(μg·h·mL-1)0.040±0.006#0.023±0.002Tmax/h11Cmax/(μg·mL-1)2.277±0.234#1.821±0.179

注：與千里光提取物組比，#P<0.05。

4 討論

分別比較了甲醇、乙腈、6 %高氯酸、三氯乙酸等有機(jī)溶劑，通過綜合比較雜質(zhì)干擾及提取回收率因素，發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀蛋白效果最好。同時考察了不同體積比的血漿-乙腈(1∶2，1∶3，1∶4)對金絲桃苷測定的影響，發(fā)現(xiàn)血漿-乙腈(1∶2)時沉淀蛋白效果已經(jīng)符合要求，如繼續(xù)加大乙腈體積，則可能會對樣品的檢測濃度帶來影響。

曾嘗試采用2015版中國藥典一部所載的千柏鼻炎膠囊中金絲桃苷的測定方法，即流動相乙腈-0.2 %醋酸水溶液(15∶85)，用于本藥動學(xué)研究中血漿樣品的金絲桃苷檢測，但通過前期的摸索研究，金絲桃苷與某內(nèi)源性成分難以完全分離，故調(diào)整流動相為乙腈-0.2 %醋酸水溶液(14∶86)。

在本研究中，兩組大鼠分別灌胃給予千里光提取物和千柏鼻炎膠囊后，金絲桃苷的藥動學(xué)研究顯示，其藥-時曲線均符合二房室模型。但灌胃千柏鼻炎膠囊后金絲桃苷的Cmax為千里光提取物的1.25倍，AUC0→∞為1.74倍。上述結(jié)果表明，千柏鼻炎膠囊中的其他中藥配伍對金絲桃苷的體內(nèi)過程有較大的影響，即中藥配伍能提高金絲桃苷口服吸收的生物利用度。此結(jié)果也從側(cè)面表明中藥在臨床上配伍應(yīng)用有其內(nèi)在的合理性，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。