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(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

抗菌脂肽是由革蘭氏陽性芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類化合物,也叫脂肽類抗生素[1-2],主要分為表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengcin)三大類[3]。其分子由一個碳脂肪酸鏈和一個含有7～10個氨基酸的肽鏈兩部分組成,因此兼有親水和親油特性。氨基酸與烴鏈上的羥基或氨基以內(nèi)酯或酰胺鍵結(jié)合形成環(huán)型脂肽[4]?？咕木哂锌咕蜕锉砻婊钚詣┨匦?在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化妝品、食品、石油開采和環(huán)境治理等領域有重要的開發(fā)和應用前景[5],已引起廣泛的關注。

不同枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生脂肽類抗菌物的情況有很大的差異,即使同一菌株,改變外界(培養(yǎng))條件也可以產(chǎn)生不同的環(huán)脂肽變異體[6-9]。因此研究特定菌株產(chǎn)生的脂肽抗菌物的性質(zhì)為脂肽的分離純化和利用奠定了基礎。

目前脂肽的發(fā)酵方式研究以液態(tài)發(fā)酵為主,但液態(tài)發(fā)酵也存在諸多問題,例如對設備的高要求、高成本等,固態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵設備簡單,單位基質(zhì)濃度高,也可以避免液態(tài)發(fā)酵過程中脂肽的表面活性特點而出現(xiàn)起泡、跑料嚴重等問題[10]。本研究中利用的發(fā)酵氮源豆粕為大豆加工副產(chǎn)品[11],用低廉的原料來提高脂肽的生產(chǎn)效益,稻草和啤酒糟[12]等已被用作生產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵基質(zhì),Kim等[13]研究表明Bacillus polyfermenticus KJS-2(BP-KJS-2)菌株用大豆作為固態(tài)基質(zhì)也可以固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)surfactin,也說明了以低廉原料產(chǎn)抗菌脂肽的固態(tài)發(fā)酵方式的巨大潛力,但是,目前對固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵過程中的顯著工藝參數(shù)和因素水平缺乏系統(tǒng)性的描述,影響抗菌脂肽的生產(chǎn)效率。

本研究對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌脂肽組分進行分析基礎上,利用Plackett-Burman對固態(tài)發(fā)酵過程的顯著因子進行篩選,采用Box-Behenken得到顯著因子的最佳水平和交互作用,確定了較優(yōu)的培養(yǎng)基組分,為抗菌脂肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及主要設備

豆粕 購于青島渤海實業(yè)有限公司;枯草芽孢桿菌N-2(BacillussubtilisN-2) 保存于中國海洋大學應用微生物實驗室；指示菌:蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) 保存于中國海洋大學應用微生物實驗室;Surfactin(表面活性素)、Iturin(伊枯草菌素)標準品 購于美國Sigma公司;種子液培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH7.0;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:豆粕50 g,K2HPO41.28 g、葡萄糖0.85 g,KCl 0.17 g,MgSO40.21 g,谷氨酸鈉0.85 g,FeSO40.13 g,MnSO40.26 g,CuSO40.13 g,蒸餾水35 mL,pH7.0 以上試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

HZQ-C型空氣浴振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠;LDZX-40BI型自動電壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DPR-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;FD-1A冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent科技公司

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及脂肽的制備 將保存在斜面上的枯草芽孢桿菌N-2接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min培養(yǎng)18 h,按照接種量10%接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵的底物與蒸餾水1∶10 (w/v)通過在室溫下攪拌1 h混合,以360×g離心10 min以除去不溶物質(zhì)。向上清液中加入6 mol/L HCl至最終pH為2.0,并在4 ℃保存12 h以沉淀粗脂肽,通過在4 ℃以360×g離心20 min取沉淀并按照1∶5 (w/v)加入甲醇萃取5 h,使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器干燥提取物。將殘余物溶于蒸餾水中,低溫冷凍干燥凍干成粉末狀,將凍干得到的脂肽抑菌物用無菌水復溶,并用0.22 μm微孔濾膜過濾制得脂肽抑菌物待測液。

1.2.2 脂肽組分鑒定 對脂肽抑菌待測液采用質(zhì)譜法(HPLC-MS)檢測產(chǎn)物中抗菌脂肽的含量。HPLC條件:色譜柱為Zorbax SB-Aq C18分析柱(4.6×150 mm,5 μm,美國Agilent科技公司);流動相:乙腈(A)、水(含0.1%甲酸)(B);洗脫速率:0.4 mL/min;柱溫25 ℃,檢測波長210 nm;洗脫過程:0～9 min,45% A～55% A;9～20 min,55% A。質(zhì)譜條件:在ESI正離子模式下,采用選擇性離子掃描SIR模式,噴霧電壓4.5 kV;鞘氣壓力40 arb;輔助氣壓力15 au;毛細管溫度320 ℃,碰撞壓0.2 Pa。

1.2.3 甲醇對脂肽聚集體的影響 在1%抗菌脂肽待測液中加入甲醇至終濃度為50%,然后用截留分子量為10 kDa的超濾管超濾,同時以不加甲醇的0.5%脂肽溶液在相同條件下進行超濾作為對照,以牛津杯法實驗驗證濾過液(B、D組)和截留液(A、C組)的拮抗活性。

1.2.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化 以脂肽抑菌率作為響應指標,采用Design Expert 8.0.6軟件,進行2步法優(yōu)化。

1.2.4.1 培養(yǎng)基關鍵因子的篩選 選取發(fā)酵培養(yǎng)基的8個因子進行篩選,本試驗所選取的8個考察因素及其代號、編碼水平見表1,其響應值為抗菌脂肽抑菌率。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平及編碼表Table 1 Factors level and codes table of PB design

1.2.4.2 響應曲面法(RSM)實驗設計 根據(jù)Plackett-Burman的實驗因素篩選結(jié)果,考慮因素的顯著效應大小及在實驗過程中的實際情況,選擇下一步試驗的中心點和高低水平,仍以抗菌脂肽抑菌率作為響應值,采用Box-Behnken(BBD)對這些因子進行響應曲面優(yōu)化(見表2),其它培養(yǎng)基條件控制為豆粕50 g,葡萄糖0.85 g,KCl 0.17 g,谷氨酸鈉0.85 g,MnSO40.26 g,CuSO40.13 g得出能使抑菌率達到最大值的培養(yǎng)基配方。并根據(jù)結(jié)果進行驗證,分析響應面結(jié)果的可靠性。

表2 Box-Behnken設計試驗因素水平及編碼表Table 2 Factors levels and codes table of Box-Behnken design

1.2.5 抑菌活性的測定

1.2.5.1 抑菌圈實驗 采用牛津杯法。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基液體培養(yǎng)12 h的蠟狀芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋至107cfu/mL,吸取0.1 mL涂牛肉膏蛋白胨平板,在其上放置高溫滅菌后的牛津杯,再加入200 μL脂肽抑菌物于牛津杯,并設置無菌水對照組,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑大小,平行實驗3次。

1.2.5.2 抑菌率的測定 挑取保存在斜面的蠟狀芽孢桿菌到種子液,37 ℃培養(yǎng)12 h,將種子液分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋至107cfu/mL,取菌液200 μL,加入到無菌的96孔板上,另外加入10 μL抗菌脂肽待測物,OD620下測定吸光度值(初始菌體密度),后放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h,后在OD620下測定吸收值(培養(yǎng)后的菌體密度);同時設置空白組(200 μL指示菌液+10 μL甲醇),其計算公式為[14]:

抑菌率I(%)=(1-AE/AC)×100

其中：I：抗菌脂肽抑菌率(%)；AE：樣品組三次平行吸光值差的平均值；AC：空白組三次平行吸光值差的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復三次,Plackett-Burman試驗及響應曲面試驗均利用Design Expert 8.0.6軟件進行設計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽組分鑒定

該抗菌脂肽的陽離子流圖如圖1所示。由圖1可知,在此固態(tài)發(fā)酵工藝條件下所產(chǎn)的抗菌脂肽產(chǎn)物主要包含6種物質(zhì),其[M+H]+離子峰值分別m/z 1043.6、1057.5、1070.2、1084.0,其中[M+2H]2+離子峰值為m/z 717.4、734.7。對比相關抗菌脂肽的報道[15-16]及預實驗中標品離子峰中Iturin的洗脫時間為3～6.5 min,Fongcin洗脫時間為7～10 min,得出此發(fā)酵產(chǎn)物中的抗菌脂肽主要為Iturin(伊枯草菌素)(m/z 1043.6、1057.5、1070.2以及1084.0);另外根據(jù)已有的報道[17],可確定還有少量的Fengcin(豐原素)(m/z 717.4、734.7)。

圖1 產(chǎn)脂肽樣品陽離子流圖Fig.1 Positive ion current chromatogram of HPLC-MS for antimicrobial lipopeptide extract

2.2 甲醇對脂肽聚集體的影響

脂肽鏈通常由疏水的脂肪酸鏈和親水的肽環(huán)組成,具有兩親特性,具有臨界膠束濃度(CMC),當其在CMC以上時其單體聚集成分子質(zhì)量比單體大2～3個數(shù)量級的膠束[18-22]。通過圖2A～圖2E圖可以得出結(jié)論,不加甲醇組中濾過液(B)未產(chǎn)生抑菌圈,說明脂肽并不能通過截留量為10 kDa的超濾管,其聚集體分子量在10 kDa以上,但是在向脂肽溶液中加入甲醇后,濾過液(D)有活性,說明經(jīng)過甲醇處理后脂肽能夠通過10 kDa的超濾離心管,結(jié)果證明脂肽能夠在溶液中形成聚集體膠束,而甲醇可以對聚集體進行打散,使膠束恢復成單體。

圖2 甲醇處理前后截留液和濾過液抑菌活性對比Fig.2 Comparison of antibacterial activity of retentate and filtrate before and after methanol treatment注:A、B組為不加甲醇組,A為截留液,B為濾過液;C、D組為加入甲醇組,C為截留液,D為濾過液;E組為50%甲醇;F組為無菌水對照組。

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基關鍵因子的篩選 采用二水平PB試驗設計對培養(yǎng)基組份進行優(yōu)化。本實驗選擇N=12的8因素(11個虛擬項因素)2水平的PB試驗設計,結(jié)果見表3。

表3 PB試驗設計及響應值Table 3 PB design and the antimicrobial rate

由表4可以得出結(jié)論,對實驗結(jié)果進行方差分析,各個模型的顯著水平是由p>|t|決定的,實驗選取的8個因素有4個到達顯著水平(p<0.05),因此選擇MgSO4、FeSO4、K2HPO4、葡萄糖作為影響發(fā)酵過程產(chǎn)脂肽的關鍵因子。但從本實驗的水平范圍內(nèi)看,MgSO4、K2HPO4、葡萄糖對脂肽的產(chǎn)生成正效應,FeSO4對脂肽的產(chǎn)生呈負效應,后續(xù)實驗應考慮降低其水平點。有研究顯示[23-24],Mg2+、K+、Mn2+和Fe2+等離子對抗菌脂肽的產(chǎn)量有影響,目前已觀察到在B.subtilis中存在鐵離子和錳離子的主動運輸系統(tǒng),二者在生物合成過程中參與了酶的合成。Wei等[25]研究了通過添加鐵鹽和錳鹽提高B.subtilisATCC 21332產(chǎn)抗菌脂肽的量,硫酸亞鐵(1.7 mmol/L)和硫酸錳的添加(0.01 mmol/L)使抗菌脂肽產(chǎn)量由0.33 g/L提高到2.6 g/L。此外,Kinsinger等[26]研究表明B.subtilis內(nèi)用于激活抗菌脂肽合成的PCP區(qū)域的Sfp蛋白活性位點需要Mg2+作為輔助因子,因此Mg2+在抗菌脂肽合成中至關重要,另有研究表明K+可促進抗菌脂肽的分泌[27]。發(fā)酵過程中葡萄糖添加量過大會使發(fā)酵物過于粘稠,影響發(fā)酵物中抗菌脂肽的提取,因此后續(xù)優(yōu)化中葡萄糖添加量不作為重要因子考慮。

表4 抗菌脂肽回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Regression coefficients and their significance for antimicrobial lipopepitide

2.3.2 響應曲面法(RSM)實驗設計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.3.2.1 響應面預測模型的建立及回歸分析檢驗 在PB試驗的基礎上利用Box-Behnken研究因子之間、因子與響應值之間的關系,本研究對顯著的3個因子進行優(yōu)化,試驗響應值與預測值見表5。利用Design Expert軟件對響應值與水平進行多元擬合,回歸方程:

表5 Box-Behnken方案及抑菌率的實際值和預測值Table 5 BBD along with the actual and predicted values of antimicrobial rate

Y=60.73+16.42A+9.9B+6.36C+5.53AB+9.24AC+3.13BC-6.76A2-12.73B2-18.77C2

式中:Y為抑菌率的預測值,A、B、C分別代表MgSO4、K2HPO4、FeSO4的編碼值。

根據(jù)變異系數(shù)對二次方程的顯著性進行分析,結(jié)果見表6。

表6 抑菌率回歸方程方差分析及其顯著性檢驗Table 6 ANOVA for the regression equation and their significance of antimicrobial rate

2.3.2.2 抑菌率響應面結(jié)果分析與驗證 通過脂肽抑菌率回歸方程所作的響應曲面圖及等高線圖可見圖3～圖5,對影響脂肽抑菌率的顯著因子之間兩兩交互效應進行評價并確定每個因子的最佳水平范圍。

圖3 MgSO4和K2HPO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and K2HPO4 concentrations

圖5 MgSO4和FeSO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and FeSO4 concentrations

圖3顯示了 FeSO4處于最佳值0.13%時,MgSO4和K2HPO4對脂肽抑菌率的交互影響效應。由圖3可以直觀地看出此兩因素的交互作用對抑菌率影響顯著(p<0.01),坡面及等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱大小,坡面陡峭,橢圓形表示兩因素交互作用顯著;而坡面平緩,圓形則與之相反;圖4顯示了K2HPO4處于最佳值1.7%時,MgSO4和FeSO4對抑菌率的交互影響顯著(p<0.05)。當MgSO4的濃度為0.39%時,在0.05%～0.13%范圍內(nèi),抑菌率隨著FeSO4濃度增加而增加,但超過此范圍,抑菌率呈現(xiàn)負增加;圖5顯示了MgSO4處于最佳值0.39%時,響應面三維圖有凸起的高點,FeSO4和K2HPO4對脂肽的交互影響較為顯著。

圖4 MgSO4和FeSO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and FeSO4 concentrations

各因素的響應面及等高線(圖3～圖5)結(jié)合二次回歸方程顯示,曲面的極值點即抗菌脂肽抑菌率的最大預測值為77.75%,其對應的條件則為:MgSO40.39%、K2HPO41.70%、FeSO40.13%。

在得到最優(yōu)條件的基礎上,選取3組相近的發(fā)酵條件進行驗證試驗,結(jié)果見表7,從表中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以得出,在最優(yōu)條件下,抗菌脂肽的抑菌率能夠達到的實際值為75.62%±0.36%,較優(yōu)化前條件下抑菌率的53.24%±0.23%,提升了近二分之一。

表7 抗菌脂肽抑菌率模型驗證試驗Table 7 Antimicrobial rates of lipopeptidemodel validation experiments

3 結(jié)論

本研究采用成本低廉的固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)生脂肽類抗生素,其組分包括伊枯草菌素(m/z 1043.60、1057.50;1070.20、1084.00),豐原素(m/z 717.40、734.70),并確定了甲醇等有機溶劑能夠?qū)χ哪z束聚集體產(chǎn)生影響并將其打散形成單體,為后續(xù)脂肽的分離純化等應用提供參考;通過Plackett-Burman和Box-Behnken試驗篩選出影響發(fā)酵過程的三個顯著因子MgSO4、K2HPO4、FeSO4,并在MgSO40.39%、K2HPO41.70%、FeSO40.13%的條件下,抗菌脂肽的抑菌率能夠達到75.62%±0.36%,較優(yōu)化前條件下抑菌率的53.24%±0.23%,提升了近二分之一,也說明了響應面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件方便快捷,是行之有效的一種方法,試驗結(jié)果也為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論參數(shù)。