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(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

隨著魚(yú)類加工業(yè)的迅速發(fā)展,魚(yú)內(nèi)臟等副產(chǎn)物的綜合利用問(wèn)題也逐漸被關(guān)注。我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)雖然發(fā)達(dá),但水產(chǎn)品加工率較低,副產(chǎn)物作為垃圾處理給環(huán)境帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān),而對(duì)副產(chǎn)物的加工卻未受到重視。魚(yú)內(nèi)臟是副產(chǎn)物中含量較多的部分,針對(duì)魚(yú)內(nèi)臟的進(jìn)一步加工有利于解決副產(chǎn)物處理問(wèn)題。

草魚(yú)是我國(guó)四大家魚(yú)之一,根據(jù)羅永康[1]對(duì)7種淡水魚(yú)肌肉和內(nèi)臟中的脂肪酸的分析,草魚(yú)內(nèi)臟中脂肪酸總量及不飽和脂肪酸含量均較高,且具有一定含量的ω-6、ω-3類脂肪酸。DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)是ω-3類脂肪酸的重要成分,能增強(qiáng)大腦的記憶力和思維能力,具有防止記憶力衰退、降低膽固醇及降低血壓等功效。目前魚(yú)油提取工藝主要有蒸煮法、稀堿水解法、萃取法、低溫提油法、水酶法、酸水解法等[2],實(shí)際生產(chǎn)中常用的是稀堿水解法和水酶法。稀堿水解法提取率較高,工藝簡(jiǎn)單,但NaOH水解后廢液的處理會(huì)增加成本、造成環(huán)境污染[3];水酶法提取魚(yú)油不使用有機(jī)溶劑,工藝簡(jiǎn)單,提取率高,提取條件溫和,對(duì)魚(yú)油品質(zhì)有較好的保護(hù)作用[4]。魚(yú)油中的多不飽和脂肪酸在貯藏過(guò)程中易氧化成氫過(guò)氧化物,氫過(guò)氧化物進(jìn)一步氧化生成短鏈的羰基化合物等,導(dǎo)致魚(yú)油酸敗變質(zhì),針對(duì)以上氧化過(guò)程有效的抑制方法有避光、避熱、低溫、使用除氧劑、添加抗氧化劑或真空、充氮貯存等。目前市場(chǎng)上采取的保藏魚(yú)油的方法主要是微膠囊化[5],或充入足量的氮?dú)?以減少魚(yú)油產(chǎn)品中氧氣的濃度,從而防止魚(yú)油氧化。

本文對(duì)魚(yú)油的提取工藝和保藏方法進(jìn)行了研究,以草魚(yú)內(nèi)臟為原料,研究不同提取方法對(duì)魚(yú)油品質(zhì)的影響,通過(guò)分析提取率、感官評(píng)價(jià)以及理化指標(biāo),確定適宜的草魚(yú)內(nèi)臟油提取的方法。并對(duì)適宜提取方法制備的魚(yú)油進(jìn)行貯藏,將感官評(píng)價(jià)和理化指標(biāo)項(xiàng)結(jié)合,可更加準(zhǔn)確的反映貯藏期間魚(yú)油品質(zhì)變化,以期為開(kāi)發(fā)高價(jià)值魚(yú)油產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚(yú) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),取現(xiàn)宰殺的新鮮草魚(yú)內(nèi)臟,剔除魚(yú)膽、魚(yú)泡;鹽酸、鐵氰化鉀、氯仿、氫氧化鈉、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)等 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶(5～160×104U/g) 上海如吉生物科技。

PH試紙 Mettler Toledo公司;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;SF-TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;JJ-2型組織搗碎機(jī) 常州億通分析儀器制造有限公司;DZ400/ZD真空充氣包裝機(jī) 上海余特包裝機(jī)械制造有限公司;SF-300塑料薄膜封口機(jī) 溫州市興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司;MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)油提取方法

1.2.1.1 稀堿水解法 參考譚汝成等[3]的方法并做改動(dòng)。稱取新鮮草魚(yú)內(nèi)臟200 g于燒杯中,勻速攪碎(400 r/min),加入200 mL蒸餾水,在水浴鍋中攪拌升溫至40～45 ℃,用10% NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0～9.0,60 ℃保溫30 min,加入4% NaCl溶液至草魚(yú)內(nèi)臟含量12%,60 ℃鹽析15 min,4000 r/min趁熱離心10 min,吸出上清液得草魚(yú)內(nèi)臟油脂。

1.2.1.2 真空提油法 稱取新鮮草魚(yú)內(nèi)臟200 g于燒杯中,勻速攪碎(400 r/min),加入60 mL蒸餾水,邊攪拌邊水浴升溫至40～45 ℃,滴加10% NaOH調(diào)pH至8.0～9.0,在真空度0.085 MPa、60 ℃條件下水解45 min,加入4% NaCl溶液至原料量12%,60 ℃鹽析15 min,4000r/min趁熱離心10 min,吸出上清液得草魚(yú)內(nèi)臟油脂[6]。

1.2.1.3 有機(jī)溶劑萃取法 稱取新鮮草魚(yú)內(nèi)臟200 g,勻速攪碎(400 r/min)置于燒杯中,加入900 mL氯仿甲醇混合液(2∶1,v/v),充分震蕩1 h,于冷凍離心機(jī)中離心,10000 r/min,3 ℃離心10 min,取氯仿層于旋蒸儀中旋蒸得魚(yú)油[7]。

1.2.1.4 水酶法 稱取200 g草魚(yú)內(nèi)臟于燒杯內(nèi),勻速攪碎(400 r/min),加等體積蒸餾水(料液比1∶1),滴加10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,加入2500 U/g原料的堿性蛋白酶,放于50 ℃水浴中保溫3 h,蒸餾水洗滌滅酶,以4000 r/min離心10 min,吸出上清液得草魚(yú)內(nèi)臟油脂[8-9]。

1.2.2 魚(yú)油得率

式中:m為離心后用膠頭滴管吸出魚(yú)油的質(zhì)量,g;m0為新鮮草魚(yú)內(nèi)臟的質(zhì)量,g。

1.2.3 感官評(píng)定方法 氣味評(píng)定方法:將魚(yú)油滴于掌心磨擦發(fā)熱,聞氣味;顏色評(píng)定方法:取10 mL魚(yú)油于試管中觀察顏色;黏度評(píng)定方法:將魚(yú)油滴在食指上,以拇指接觸緩慢拉伸以判斷黏稠程度;透明度評(píng)定方法:取10 mL魚(yú)油于試管中,對(duì)著光源觀察是否有懸浮物[10]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 魚(yú)油的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(分)Table 1 Sensory evaluation of fish oil(scores)

1.2.4 理化成分檢測(cè)方法 水分:重量法,參照GB 5009.3-2016;碘價(jià):硫代硫酸鈉滴定法,參照GB/T 5532-2008;酸價(jià):氫氧化鈉滴定法,參照GB 5009.229-2016;過(guò)氧化值:硫代硫酸鈉回滴法,參照GB 5009.227-2016;含皂量:鹽酸回滴法,參照GB/T 5533-2008。

1.2.5 貯藏條件的研究

1.2.5.1 溫度對(duì)魚(yú)油貯藏特性的影響 將提取的草魚(yú)內(nèi)臟油置于250 mL棕色試劑瓶,密封避光,分別于4、10、25、35 ℃下貯藏180 d,定期(前60 d,取樣頻率5～8 d/次;60 d以后,取樣頻率為10～15 d/次,下同)檢測(cè)油樣的過(guò)氧化值(POV)、酸價(jià)(AV)和感官品質(zhì)。

1.2.5.2 抗氧化劑對(duì)魚(yú)油貯藏特性的影響 將提取的草魚(yú)內(nèi)臟油置于250 mL棕色試劑瓶,分別添加0.02%TBHQ、0.02%BHT、0.1%維生素E并攪拌均勻,未添加抗氧化劑為對(duì)照組,于25 ℃下密封避光貯藏180 d,定期檢測(cè)油樣的POV、AV和感官品質(zhì)。

1.2.5.3 包裝條件對(duì)魚(yú)油貯藏特性的影響 將提取的草魚(yú)內(nèi)臟油,分別進(jìn)行真空包裝(于室溫下,將高溫蒸煮袋內(nèi)抽真空后密封)和充氮包裝(于室溫下,向高溫蒸煮袋內(nèi)通入氮?dú)? min后密封),空氣包裝為對(duì)照組,于25 ℃下避光貯藏180 d,定期檢測(cè)油樣的POV、AV和感官品質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)均進(jìn)行兩次重復(fù),每次重復(fù)進(jìn)行三次平行,所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010與SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn),p>0.05判定為無(wú)顯著差異,p<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)魚(yú)油品質(zhì)的影響

2.1.1 提取方法對(duì)魚(yú)油感官品質(zhì)的影響 由表2魚(yú)油感官品質(zhì)評(píng)分可知,真空抽提和水酶法提取的魚(yú)油顏色純凈清亮,渾濁度低,氣味良好,感官品質(zhì)優(yōu)于其它兩種提取方法;稀堿水解法耗時(shí)最短,魚(yú)油感官品質(zhì)僅次于真空抽提法和水酶法;有機(jī)溶劑萃取法所提魚(yú)油氣味刺鼻,色澤較深,粘度高,感官品質(zhì)較差。

表2 魚(yú)油感官品質(zhì)評(píng)分(分)Table 2 Sensory scores of fish oil quality(scores)

2.1.2 提取方法對(duì)魚(yú)油得率及品質(zhì)的影響 由表3不同提取方法制備魚(yú)油的得率及品質(zhì)分析可知,不同方法的魚(yú)油得率差異顯著(p<0.05),水酶法魚(yú)油得率較高(53.67%),稀堿水解法次之,其他兩種方法較低,可能是由于蛋白酶對(duì)內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)進(jìn)行的水解破壞了蛋白質(zhì)與脂肪等物質(zhì)的結(jié)合,從而更利于內(nèi)臟油脂的提取。

表3 不同提取方法制備魚(yú)油的得率及品質(zhì)分析Table 3 Yield and quality of fish oil extracted with different methods

參照國(guó)家SC-T 3502-2016《魚(yú)油水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》判斷提取魚(yú)油品質(zhì)[10]:四種不同方法提取魚(yú)油水分及揮發(fā)物均符合粗制魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(水分及揮發(fā)物≤0.3%)。酸價(jià)、過(guò)氧化值是反映油脂氧化程度的重要指標(biāo),其值可有效反映魚(yú)油的貯藏品質(zhì)[11]。酸價(jià)體現(xiàn)了游離羧酸基團(tuán)的量,可反映油脂的酸敗程度。有機(jī)溶劑萃取法、真空抽提法、稀堿水解法提取魚(yú)油的酸價(jià)較高,僅達(dá)粗制魚(yú)油二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(AV≤15 mg/g),而水酶法可達(dá)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(AV≤8 mg/g)。油脂初級(jí)氧化產(chǎn)物為過(guò)氧化物,其值在油脂貯藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生不斷變化,POV表示1 kg油脂中過(guò)氧化產(chǎn)物的含量,可反映油脂氧化程度。有機(jī)溶劑萃取法提取魚(yú)油的過(guò)氧化值最高,僅達(dá)精制魚(yú)油二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求(POV≤10 meq/kg),其他方法可達(dá)精制魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求(POV≤5 meq/kg)。不皂化物值可以反映油脂的純度,四種方法制備油脂的不皂化物含量均達(dá)精制魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(不皂化物≤1.5%)。碘價(jià)反映了油脂的不飽和程度,稀堿水解法和水酶法提取油脂的碘價(jià)達(dá)到精制魚(yú)油指標(biāo)要求(碘價(jià)≥140 g/100 g),其他方法均不達(dá)標(biāo)。

綜上所述,水酶法是比較理想的魚(yú)油提取方法,提取條件為pH8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h、酶用量2500 U/g、料液比1∶1。該條件下提取的粗魚(yú)油除酸價(jià)外,均符合精制魚(yú)油二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求(水分及揮發(fā)物≤0.2%、酸價(jià)≤3.0 mg/g、過(guò)氧化值≤10 meq/kg、不皂化物≤3.0%、碘價(jià)≥140 g/100 g、雜質(zhì)≤0.1%)。

2.2 魚(yú)油的貯藏特性研究

2.2.1 不同貯藏條件下魚(yú)油的感官品質(zhì) 魚(yú)油中不飽和脂肪酸含量較高,在貯藏過(guò)程中易氧化酸敗,外觀上表現(xiàn)為由透明狀變?yōu)檎吵頊啙?表面形成硬膜,氣味也由新鮮魚(yú)腥味逐漸變?yōu)榇瘫堑墓?。改變魚(yú)油的貯藏溫度、添加不同的抗氧化劑、采用不同的包裝條件,研究魚(yú)油的感官品質(zhì)隨時(shí)間的變化情況,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1(a)可知,在避光、無(wú)抗氧化劑、密封條件下,溫度越高,魚(yú)油感官品質(zhì)下降越快,4 ℃條件下草魚(yú)內(nèi)臟油穩(wěn)定性最佳,46 d時(shí)才稍有哈喇味;由圖1(b)可知,在避光、25 ℃、密封的貯藏條件下,三種抗氧化劑均能減緩魚(yú)油感官品質(zhì)的變化,其中0.02% TBHQ的抗氧化效果最好,保藏78 d以上才略有哈喇味;由圖1(c)可知,在避光、無(wú)抗氧化劑、25 ℃條件下,真空包裝貯藏較好,保藏75 d以上略有哈喇味。

圖1 不同貯藏條件下魚(yú)油感官品質(zhì)的變化Fig.1 Changes of sensory quality of fish oil under different storage conditions注：a:溫度；b:抗氧化劑；c:包裝條件。

2.2.2 不同貯藏溫度下魚(yú)油的理化特性 溫度對(duì)魚(yú)油貯藏過(guò)程中POV值和AV值變化的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,草魚(yú)內(nèi)臟油的POV值和AV值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。4 ℃時(shí)氧化速率最慢,35 ℃時(shí)氧化速率最快,即溫度越高,草魚(yú)內(nèi)臟油的POV值和AV值變化曲線越陡,相應(yīng)的,油樣產(chǎn)生游離脂肪酸和初級(jí)氧化產(chǎn)物的速度越快,貯藏品質(zhì)越差。研究表明,油樣貯藏溫度的增高可以加快氧化反應(yīng)速度,故低溫有利于魚(yú)油貯藏。

圖2 不同貯藏溫度對(duì)魚(yú)油貯藏理化特性的影響Fig.2 Effects of different storage temperatures on the chemical properties of fish oil

2.2.3 魚(yú)油在不同包裝條件下貯藏的理化特性 氣體條件對(duì)魚(yú)油貯藏理化品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知,各組樣品整體趨勢(shì)為:隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)魚(yú)油的POV值和AV值增大。25 ℃、避光、無(wú)抗氧化劑貯藏條件下,真空包裝與充氮包裝的魚(yú)油POV和AV的變化明顯慢于密封包裝,其中真空包裝抗氧化性能最好,能有效延緩油品氧化速度,較好保持儲(chǔ)油品質(zhì)。這說(shuō)明油脂氧化速度隨氧氣分壓的增大而增大,有效隔絕油脂與氧的接觸,就能大大抑制油脂氧化酸敗[12]。

圖3 不同包裝條件對(duì)魚(yú)油貯藏理化特性的影響Fig.3 Effects of different package on the chemical properties of fish oil

2.2.4 抗氧化劑對(duì)魚(yú)油貯藏理化特性的影響 油脂氧化通常為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),即在熱、光和金屬離子等外界催化作用下產(chǎn)生自由基,隨之引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。方式主要有光敏氧化,自動(dòng)氧化和酶促氧化,其中自動(dòng)氧化是最為常見(jiàn)的方式。發(fā)揮抗氧化作用很重要的途徑之一是:加入可消除鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的自由基的抗氧化劑,終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng),抑制油脂氧化[13]。TBHQ和BHT均屬于酚類抗氧化劑,可以有效清除活性自由基,并形成穩(wěn)定的自由基中間體,從而阻止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生?？寡趸瘎?duì)魚(yú)油貯藏理化品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4,由圖4可知,添加抗氧化劑樣品的POV值和AV值上升較緩慢,其中添加0.02% TBHQ抗氧化性能最好,0.02%BHT次之,0.1% VE稍差。

圖4 不同抗氧化劑對(duì)魚(yú)油貯藏理化特性的影響Fig.4 Effect of different antioxidants on the chemical properties of fish oil

3 討論與結(jié)論

本文主要對(duì)比研究了稀堿水解法、真空抽提法、有機(jī)溶劑萃取法和水酶法四種魚(yú)油提取方法。結(jié)果表明,水酶法提取魚(yú)油得率顯著高于其他方法,且此法制備魚(yú)油理化品質(zhì)較優(yōu),除酸價(jià)外各指標(biāo)均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)精制魚(yú)油二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求。水酶法提取條件為pH8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h、酶用量2500 U/g、料液比1∶1;在該條件下草魚(yú)內(nèi)臟油的得率為53.67%,含水量為0.20%,酸價(jià)為5.78 mg/g,過(guò)氧化值為4.44 meq/kg,不皂化物含量為0.28%,碘價(jià)為145.93 g/100 g。此外,稀堿水解法提取魚(yú)油得率及品質(zhì)次之,這可能由于二者分別通過(guò)蛋白酶或稀堿水解內(nèi)臟蛋白質(zhì),破壞蛋白質(zhì)與脂肪等物質(zhì)的結(jié)合,利于提取魚(yú)油得率及品質(zhì)的改善。據(jù)薛淑靜等[14]的研究,酶水解法不僅提取率高魚(yú)油品質(zhì)好,水解產(chǎn)生的酶解液對(duì)環(huán)境無(wú)污染,更能提高下腳料中蛋白質(zhì)的利用率,綜合考慮,水酶法的綜合效益最好。

魚(yú)油的氧化穩(wěn)定性受到多種因素影響[15],光照,溫度,酶,金屬催化劑都可以誘發(fā)魚(yú)油的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng),導(dǎo)致其品質(zhì)下降。為阻止鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng),延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期,可從降低溫度、降低氧氣分壓、阻止自由基產(chǎn)生等方面采取措施。本文采用感官評(píng)價(jià)和理化分析相結(jié)合的考察方式從溫度、包裝條件、抗氧化劑角度探究提取魚(yú)油合適貯藏條件。結(jié)果表明,低溫,降低氧氣分壓,添加抗氧化劑均能較好減緩魚(yú)油氧化變質(zhì)的速度,提高魚(yú)油的貯藏穩(wěn)定性。其中添加0.02% TBHQ的效果優(yōu)于BHT和VE,這可能與其分子結(jié)構(gòu)中羥基較易貢獻(xiàn)氫原子參與鏈?zhǔn)街袛喾磻?yīng)相關(guān),從而有效抑制油脂氧化反應(yīng)。