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(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,山西晉中 030619;2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

連翹(Forsythiasuspensa)為木犀科連翹屬植物,連翹的主要化學(xué)成分有苯乙醇苷類、木脂素類、五環(huán)三萜類、黃酮類、揮發(fā)油及酚酸類等[1]。連翹果有抑菌、強心、利尿、鎮(zhèn)吐等藥理作用[2],為雙黃連口服液、雙黃連粉針劑、銀翹解毒沖劑等中藥制劑的主要原料,對枯草芽孢桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白喉桿菌及霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等具有抑制作用[1]。連翹葉作為藥材副產(chǎn)物,已入選新食品原料,其化學(xué)成分主要包括木脂素類、揮發(fā)油及其萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、生物堿類、有機酸類及多糖類等[3]。連翹葉具有抑菌、保肝、抗氧化、抗衰老、保護心臟、降血糖、抗疲勞、抗癌、降脂等藥理作用[4]。研究表明,連翹葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌有較強的抑制作用,且其抑菌活性強于連翹果實和連翹花[5-6]。連翹葉的抑菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性,在中性和弱酸性環(huán)境中抑菌活性較強,Ca2+、Cu2+、Fe3+能增強連翹葉抑菌能力[7],具有開發(fā)為天然食品防腐劑的潛力。

大量研究表明,連翹果和連翹葉對多種細菌、真菌具有抑制作用,連翹苷、連翹脂素、熊果酸、蘆丁為連翹中主要的抑菌活性成分[8],也有實驗表明,連翹酚才是連翹的有效抑菌成分[9]。由此可見,目前對連翹中主要抑菌成分存在不同的認識。為了進一步研究連翹果、連翹葉乙醇提取物的抑菌活性及其組成成分的差異,本實驗采用抑菌圈實驗比較了連翹果與連翹葉乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用;分析了連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響,采用紫外分光光度法測定了金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)及堿性磷酸酶含量的變化情況;進一步采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了連翹果、連翹葉乙醇提取物中的揮發(fā)性成分,并探討了其組成成分與抑菌作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉 分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯化鈉 分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;乙醇 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;甲醇 色譜純,德國Merck;堿性磷酸酶試劑盒 南京建成生物科技有限公司;連翹果(成熟果實)、連翹葉(六月份采摘) 山西省安澤縣連翹GAP生產(chǎn)基地;大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 26112)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6051) 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供。

U-3000型紫外分光光度計 美國奧泰科技(中國)有限公司;SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DY04型高壓滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司;HZC-250型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 北京乾明基因技術(shù)有限公司;7890B-5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 連翹果、連翹葉乙醇提取物的制備 連翹果、連翹葉粉碎過篩后,分別以1∶10 (g/mL)料液比加入70%乙醇,80～82 ℃回流提取2 h,提取兩次,過濾后合并濾液,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到連翹果、連翹葉乙醇提取物。取連翹果、連翹葉乙醇提取物分別用蒸餾水稀釋,制成50 mg/mL的分散液用于抑菌圈實驗。

1.2.2 菌懸液的制備 分別將活化好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在無菌環(huán)境下用接種環(huán)從試管斜面挑取一環(huán)于10 mL已滅菌的液體肉湯培養(yǎng)基中,充分震蕩均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,調(diào)整菌懸液濃度為105CFU/mL備用。

1.2.3 抑菌圈實驗 細菌抑菌圈試驗采用濾紙片法,將滅菌融化后的肉湯培養(yǎng)基冷卻至45 ℃后傾注于平板中,每皿約20 mL。待平板充分凝固后,向平板上滴加0.2 mL已稀釋至105CFU/mL的菌懸液,涂布均勻,靜置至表層菌液充分干燥。將直徑為8 mm的滅菌濾紙片放入已干燥的涂布菌液的平板上,每片濾紙片加樣20 μL,每種樣品一片,使用生理鹽水做空白,每個平板重復(fù)3個,37 ℃恒溫倒置培養(yǎng),根據(jù)預(yù)實驗培養(yǎng)16 h時抑菌圈最大,本實驗培養(yǎng)16 h 后測定抑菌圈直徑。

1.2.4 最小抑菌濃度的測定 采用試管倍比稀釋法[10]測定樣品對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。取11支試管標(biāo)記為1～11號,首先在每支試管中加入液體培養(yǎng)基2 mL,高壓滅菌后在1號試管中加入樣品2 mL振蕩均勻,然后吸取2 mL至2號試管,振蕩均勻后再吸取2 mL至3號試管,如此連續(xù)倍比稀釋至10號試管,并從10號試管中吸取2 mL棄去,11號試管為不含樣品的生長對照。在每管內(nèi)加入濃度為105CFU/mL菌懸液各0.1 mL,于37 ℃中培養(yǎng)12 h,用肉眼觀察不發(fā)生渾濁、沉淀、表面生長任一現(xiàn)象的最小的樣品濃度為該樣品的最低抑菌濃度。如培養(yǎng)液肉眼不易辨明菌體的生長情況,可從各管中各取0.1 mL接于固體平板上,于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察有無菌落生長,并加以判斷。

1.2.5 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑菌機理的研究

1.2.5.1 對生長曲線的影響 金黃色葡萄球菌活化后,接種于液體肉湯培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,稀釋為105CFU/mL的菌懸液,取菌懸液與連翹果、連翹葉乙醇提取物分別混合,使連翹果、連翹葉乙醇提取物的終濃度分別為其最低抑菌濃度,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),另外以無菌水代替樣品做空白對照。每培養(yǎng)2 h取樣,采用分光光度計在600 nm測菌液的OD值[11]。

1.2.5.2 對培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響 取105CFU/mL的菌懸液與連翹果、連翹葉乙醇提取物分別混合,使樣品濃度分別為其最低抑菌濃度,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),另外以無菌水代替樣品做空白對照。每間隔2 h取菌液3 mL,12000 r/min離心5 min取上清液,在260 nm測定OD值,該值可以代表細胞內(nèi)DNA/RNA的泄漏程度由此反映出細胞膜的受損情況[12]。

1.2.5.3 對培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(AKP)含量的影響 取稀釋為105CFU/mL的菌懸液與連翹果、連翹葉乙醇提取物分別混合,使樣品濃度分別為其最低抑菌濃度,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),另外以無菌水代替樣品做空白對照?；旌吓囵B(yǎng)后取菌液1 mL,3500 r/min離心10 min,取上清液用AKP試劑盒方法測定,期間每2 h測定一次。

1.2.6 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析 取連翹果、連翹葉乙醇提取物以色譜級甲醇稀釋后,過 0.22 μm有機濾膜,采用安捷倫7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析。

色譜條件:色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃,采用不分流進樣,載氣為高純氦氣,流速為1.2 mL/min;進樣量1 μL;離子源溫度230 ℃,EI源電壓70 eV,四級桿溫度150 ℃。程序升溫:初始溫度50 ℃,以10 ℃/min的速率升至80 ℃,保持3 min,再以15 ℃/min的速率升至300 ℃,保持5 min。檢索譜庫:NIST14。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示(n=3),Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹果、連翹葉乙醇提取物的抑菌圈實驗結(jié)果

連翹果、連翹葉乙醇提取物對3種供試細菌抑菌圈結(jié)果見表1。由表1可以看出,兩種提取物對3種供試細菌都具有一定的抑制效果,連翹果、連翹葉乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為(13.3±0.5)、(14.7±0.7) mm,對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為(11.0±0.6)、(12.7±1.2) mm,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(12.0±0.9)、(15.0±0.8) mm,表明連翹葉乙醇提取物的抑菌圈直徑普遍大于連翹果乙醇提取物,該結(jié)果與前期研究結(jié)果一致[5-6]。

表1 連翹果、連翹葉乙醇提取物對供試細菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Diameter inhibition zone of ethanol extracts from Forsythia suspensa fruit and Forsythia suspensa leaves against tested bacteria(mm)

2.2 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度

采用倍比稀釋法測定連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度,由于培養(yǎng)液肉眼不易辨明菌體的生長情況,從各管中取培養(yǎng)液接于固體平板上,于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察有無菌落生長,具體實驗結(jié)果見表2,連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為6.250、3.125 mg/mL。

表2 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度Table 2 The MIC of ethanol extracts from Forsythia suspensa fruit and Forsythia suspensa leaves against Staphylococcus aureus

2.3 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌機理研究

2.3.1 對生長曲線的影響 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響如圖1所示。從圖1可以看出,對照組具有典型的生長曲線特征。兩種樣品處理組在其最低抑菌濃度下抑制了金黃色葡萄球菌的生長,培養(yǎng)14 h后,兩個樣品組的OD600有一定程度的增加,但在整個生長過程中OD600始終低于對照組,表明連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的生長繁殖起到了明顯的抑制作用,且連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生長繁殖的抑制作用大于連翹果乙醇提取物。

圖1 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.1 Effects of ethanol extract from Forsythia suspensa fruits and Forsythia suspensa leaves on growth curve of Staphylococcus aureus

2.3.2 對培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的影響 細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的一個主要影響因素,核酸等大分子物質(zhì)的泄漏則表明細胞膜完整性遭到了破壞[13]。連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中核酸等大分子物質(zhì)的影響如圖2所示。從圖2可以看出,對照組在整個生長過程中的OD260值非常穩(wěn)定,表明無細胞內(nèi)容物外溢;而樣品組隨著時間的推移,OD260值快速上升后趨于穩(wěn)定,說明樣品組細胞內(nèi)容物外溢,核酸等大分子物質(zhì)流出;初步判斷連翹果、連翹葉乙醇提取物能作用于金黃色葡萄球菌細胞膜,損壞了細胞膜的完整性,致使核酸泄漏,且16 h前連翹葉乙醇提取物的作用速度大于連翹果乙醇提取物,但16 h后連翹果乙醇提取物的作用強度大于連翹葉乙醇提取物。

圖2 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌大分子物質(zhì)泄漏的影響Fig.2 Effects of ethanol extract from Forsythia suspense fruit and Forsythia suspensa leaves on large molecules leakage of Staphylococcus aureus

2.3.3 對培養(yǎng)液中AKP含量的影響 AKP是存在于細胞壁與細胞膜之間的一種酶,正常情況下在細胞外不能檢測到其活性,但當(dāng)細胞壁遭到破壞后,細胞壁通透性增加使AKP泄漏到細胞外,通過檢測胞外AKP含量的變化可反映出細胞壁的破壞情況[14]。連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中AKP的影響如圖3所示。從圖3可以看出,對照組培養(yǎng)液中AKP含量0～6 h緩慢增加，后趨于穩(wěn)定,且一直處在較低的水平;連翹果、連翹葉乙醇提取物處理組0～8 h AKP含量快速增加,且在0～8 h內(nèi)連翹葉乙醇提取物處理組培養(yǎng)液中AKP的含量高于連翹果乙醇提取物處理組,10 h以后連翹果乙醇提取物處理組培養(yǎng)液中AKP的含量高于連翹葉乙醇提取物處理組。由此可知,連翹果、連翹葉乙醇提取物可破壞金黃色葡萄球菌細胞壁的完整性,造成菌體細胞壁通透性增加,且連翹葉乙醇提取物的作用速度大于連翹果乙醇提取物。

圖3 連翹果、連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中堿性磷酸酶含量的影響Fig.3 Effects of ethanol extract from Forsythia suspensa fruit and Forsythia suspensa leaves on the content of alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

2.4 連翹果、連翹葉乙醇提取物的GC-MS分析結(jié)果

對連翹果、連翹葉乙醇提取物進行氣質(zhì)聯(lián)用分析,總離子流圖如圖4。

圖4 連翹果(A)、連翹葉(B)乙醇提取物總離子流圖Fig.4 Total ionic chromatogram of ethanol extract from Forsythia suspense fruit(A) and Forsythia suspensa leaves(B)

在保留時間 2～25 min內(nèi),對各個峰經(jīng)計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索,人工譜圖解析得到多種物質(zhì),其名稱、分子式、百分含量列于表3中。連翹果乙醇提取物中鑒定出22種物質(zhì),主要包括醇類(38.55%)、酚類(14.00%)、酮類(11.07%)、酯類(6.11%)、烯烴類(3.64%)、烷烴類(1.49%)、醛類(1.56%)等;連翹葉乙醇提取物中鑒定出26種物質(zhì),包括醇類(34.97%)、烯烴類(12.71%)、酚類(12.26%)、烷烴類(11.05%)、酯類(6.90%)、酮類(2.51%)等;連翹葉乙醇提取物中烯烴和烷烴類物質(zhì)是主要的成分,含量在10%以上,而連翹果乙醇提取物中烯烴和烷烴類物質(zhì)含量很少,酚酮類物質(zhì)含量較多。醇類是連翹果和連翹葉乙醇提取物中最主要的揮發(fā)性成分,含量在30%以上,連翹果、連翹葉乙醇提取物中還含有醛類、酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),醇類、醛類、酮類物質(zhì)可進入菌體細胞內(nèi),破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì),抑制微生物的新成代謝[15]。連翹果乙醇提取物鑒定出3種酚類物質(zhì)包括對羥基苯乙醇(2.73%)、3-羥基-2-甲基苯甲醛(4.00%)、2,5,-二羥基苯乙酸(7.27%);連翹葉乙醇提取物中鑒定出6種酚類物質(zhì),除了對羥基苯乙醇(1.73%)、3-羥基-2-甲基苯甲醛(0.11%)、2,5,-二羥基苯乙酸(7.10%),還包括苯酚(1.20%)、1,3-苯二醇單乙酸脂(1.30%)、2-羥基-3-甲基苯甲醛(0.82%),酚類物質(zhì)具有殺菌效果是天然植物揮發(fā)性物質(zhì)中主要的殺菌劑[16]。連翹果、連翹葉乙醇提取物中分別鑒定出1.49%和11.05%的烷烴類物質(zhì),根據(jù)文獻報道烷烴類也具有一定的抑菌效果[17]。

表3 連翹果與連翹葉乙醇提取物的化學(xué)成分Table 3 Chemical compositions of Forsythia suspense fruit and Forsythia suspensa leaves extract

3 結(jié)論

連翹果與連翹葉乙醇提取物對細菌具有抑制效果,連翹葉乙醇提取物對三種供試細菌的抑制作用大于連翹果乙醇提取物;連翹果和連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為6.25、3.125 mg/mL。連翹果、連翹葉乙醇提取物可以影響金黃色葡萄球菌細胞壁、細胞膜的完整性,導(dǎo)致菌體中核酸等大分子物質(zhì)及堿性磷酸酶的泄漏,從而抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖,且連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生長繁殖的抑制作用大于連翹果乙醇提取物。連翹果與連翹葉乙醇提取物中含有多種醇類、酚類、醛類、酮類、烷烴、烯烴類物質(zhì),這些物質(zhì)對其抑菌活性有較大的貢獻,而且其抑菌活性的差異主要與這些物質(zhì)的種類和含量有關(guān)。