萬(wàn)鐵林，馮廣帥

(安陽(yáng)市第五人民醫(yī)院，河南 安陽(yáng) 455000)

肝癌即肝臟惡性腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性肝癌主要為肝細(xì)胞癌(HCC)，其病因及確切分子機(jī)制尚不完全清楚[1]，近年來(lái)肝癌的基礎(chǔ)研究不斷取得新的進(jìn)展[2－4]，但發(fā)病率和病死率仍呈逐年升高趨勢(shì)[5]，中國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率位于世界較高水平[6，7]。而在我國(guó)感染乙型肝炎病毒是肝癌發(fā)病的主要原因，我國(guó)肝癌患者中的乙型肝炎病毒感染率約占90%[8，9]，乙型肝炎病毒X蛋白是引起HCC最主要的原因，乙型肝炎相關(guān)性發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)特效的治療性藥物。因此，探索新的治療靶點(diǎn)是目前治療乙型肝炎相關(guān)性的關(guān)鍵所在[10]。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來(lái)，我們認(rèn)識(shí)到HCC的發(fā)生發(fā)展是多基因相互作用的過(guò)程，同時(shí)涉及多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。異黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，它調(diào)節(jié)著眾多信號(hào)通路，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用。而人類Wnt基因家族由19個(gè)家族成員組成[11]，Wnt信號(hào)通路主要參與各種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持以及胚胎的正常發(fā)育過(guò)程，在眾多惡性腫瘤中，MTDH基因和Wnt5b的表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌、膀胱癌等。然而，一直未有MTDH和Wnt5b在HCC組織中表達(dá)情況及作用機(jī)制的系統(tǒng)研究。

本研究探討了乙肝相關(guān)性HCC組織中MTDH及Wnt5b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)了乙肝相關(guān)性HCC組織中MTDH mRNA及Wnt5b mRNA的表達(dá)情況，為今后研究MTDH和Wnt5b在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)論證。

1 材料與方法

1.1.1 材料 總RNA提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （購(gòu)自大連Takara生物有限公司），免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒，兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司），山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP（PV－6000）（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗人甘油醛－3－磷酸脫氫酶單克隆抗體及鼠抗兔單克隆二抗（均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司），一抗稀釋液（P0103）（購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR引物為上海生工生物公司合成，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。紫外分光光度?jì)(日本HITACHI)，PCR儀 (美國(guó)ABI公司)， 顯微鏡 （德國(guó)Kruess公司）。

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源 肝癌患者知情，同意外科手術(shù)后，取腫瘤組織，其中男29例、女25例；另收集2例外傷致肝破裂切除的部分組織作為正常組織。將標(biāo)本均分為兩組，一組用于組織提取，在液氮中冰凍保存，另一組則加入多聚甲醛，在室溫下固定，流水漂洗后，室溫過(guò)夜，包埋，零下保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 標(biāo)本用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片厚度為4μm，在65℃下烘烤2h，用二甲苯脫蠟60min，水化用梯度酒精，低溫微波修復(fù)抗原10min，將其冷卻至室溫，再加入3%過(guò)氧化氫浸染20min，然后加入1%BSA封閉30min，一抗4℃孵育過(guò)夜，用PBS溶液洗3次，每次2min，次日加入二抗室溫孵育30min，加入DAB顯色，水洗充分后，再用蘇木素染核10min，緊接著1%鹽酸酒精進(jìn)行分化，加氨水藍(lán)化，用乙醇梯度脫水，二甲苯使透明，最后封片。

1.2.2 組織總RNA抽提 分別取已經(jīng)凍存于液氮罐的乙肝相關(guān)性HCC組織，提取RNA（操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度和含量，在260nm和280nm處的紫外吸光度值比值在 2.0±0.1 之間。 取 RNA 2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明和相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，PCR實(shí)驗(yàn)中所使用的引物見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR中使用的引物

2 結(jié)果

2.1 MTDH和Wnt5b在乙肝相關(guān)性肝癌組織的表達(dá)及相關(guān)性 免疫組化檢測(cè)MTDH和Wnt5b在乙肝相關(guān)性肝癌組織中均有表達(dá)，54例乙肝相關(guān)性肝癌組織中MTDH表達(dá)陽(yáng)性率為77.78%，Wnt5b表達(dá)的陽(yáng)性率為70.37%，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，MTDH及Wnt5b表達(dá)陽(yáng)性與患者的年齡、性別、無(wú)相關(guān)性，但與腫瘤直徑顯著相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

2.2 乙肝相關(guān)性肝癌組織中MTDH和Wnt5b表達(dá)的臨床病理學(xué)特征 通過(guò)對(duì)54例確診肝癌病例肝組織、2例正常肝臟對(duì)照組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果表明肝癌組織有MTDH和Wnt5b表達(dá)，且肝癌組織中MTDH明顯高于正常肝臟組織，正常肝臟組織中幾乎未發(fā)現(xiàn)明顯的MTDH表達(dá)，而正常肝臟組織中的Wnt5b的表達(dá)明顯高于肝癌組織，顯微鏡下見(jiàn)乙肝相關(guān)性HCC組織中MTDH主要表達(dá)于胞漿，部分表達(dá)于細(xì)胞核，而Wnt5b表達(dá)主要在細(xì)胞核。見(jiàn)圖1。

表2 MTDH和Wnt5b在乙肝相關(guān)性肝癌組織的表達(dá)

圖1 免疫組化檢測(cè)MTDH及Wnt5b在肝癌組織中的表達(dá)(×200)

2.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè) 對(duì)正常肝臟組織和肝癌組織應(yīng)用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，并利用RT－PCR檢測(cè)MTDH、Wnt5b的mRNA相對(duì)表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中MTDH mRNA表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，但肝癌組織Wnt5b mRNA的表達(dá)卻低于正常的肝臟組織，見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 不同肝臟組織中MTDH和Wnt5b mRNA表達(dá)水平

目前關(guān)于HCC發(fā)生機(jī)制表明，肝炎病毒感染（如乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒）及毒素（如黃曲霉毒素）或代謝等致病因素導(dǎo)致組織損傷后形成肝硬化和因?yàn)镠CC中的癌基因或腫瘤抑制基因是占主導(dǎo)地位的兩種主要致病機(jī)制，兩者均與幾種重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的異常激活相關(guān)[13]，乙型肝炎病毒感染是肝細(xì)胞肝癌的首要致病因素，預(yù)防肝癌的最有效方法是將乙肝的病毒，載量控制在正常范圍，隨著近年來(lái)靶向治療技術(shù)的迅猛發(fā)展，已證實(shí)靶向作用于信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因有助于逆轉(zhuǎn)、延遲或阻止腫瘤發(fā)生[14]。而對(duì)于已確診的乙肝相關(guān)性肝癌患者是否有必要進(jìn)行分子靶向藥物治療還有待研究。因此，探索HCC演進(jìn)的分子機(jī)制及尋求其演進(jìn)過(guò)程中潛在的治療靶點(diǎn)無(wú)疑具有十分重要臨床意義。

癌基因、抑癌基因在腫瘤發(fā)生的不同階段會(huì)出現(xiàn)不同的功能異常，是一個(gè)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。如今發(fā)現(xiàn)參與了HCC的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程的基因多達(dá)數(shù)十種，而MTDH和Wnt5b是近幾年發(fā)現(xiàn)了一些與HCC相關(guān)的新基因。MTDH是個(gè)高度保守的基因，近年的研究顯示，MTDH在多種人類腫瘤中過(guò)表達(dá)，是在人免疫缺陷病毒1感染或腫瘤壞死因子α處理過(guò)的人原始胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高的基因，檢測(cè)其表達(dá)程度有助于對(duì)HCC在臨床上進(jìn)行早期診斷，MTDH對(duì)腫瘤來(lái)說(shuō)是一個(gè)有效的評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，參與多個(gè)重要的信號(hào)調(diào)控通路，這其中包括三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）等信號(hào)通路[15]，它們?cè)诖龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮重要作用，例如Haras、NF-κB 和 Wnt/β-catenin。 MTDH 異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖、凋亡耐受、侵襲轉(zhuǎn)移、新生血管形成等，而它的具體調(diào)控機(jī)制則涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子表達(dá)，但其致瘤機(jī)制并不完全明了，它可能是一個(gè)潛在的癌基因，而HBV感染可能是MTDH異常表達(dá)的一個(gè)始動(dòng)因素。Wnt信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上極其保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，目前研究較多的是經(jīng)典Wnt/βcatenin信號(hào)傳導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)它在胚胎發(fā)育、組織再生、造血、細(xì)胞增殖分化與遷移等過(guò)程和功能中發(fā)揮的作用十分關(guān)鍵[16]，在許多組織和器官干細(xì)胞的分化和更新過(guò)程中起到重要的介導(dǎo)作用[17，19]。國(guó)內(nèi)HCC中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究目前主要集中于對(duì)其上游和或下游個(gè)別基因異常表達(dá)的探討，Wnt信號(hào)通路的異常激活已被證實(shí)與包括HCC在內(nèi)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。在家族成員中，Wnt5b作為Wnt通路眾多配體之一，Wnt5b參與了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

在本研究中，我們通過(guò)收集肝癌組織和正常組織分別檢測(cè)MTDH和Wnt5b的表達(dá)水平，在對(duì)正常肝臟組織和肝癌組織進(jìn)行免疫組化和PCR擴(kuò)增時(shí)，正常組織和肝癌組織中MTDH都有一定量的表達(dá)，但正常組織的表達(dá)明顯低于肝癌組，與周文波[12]發(fā)現(xiàn)正常的肝臟組織Wnt5b的表達(dá)比癌旁組織和肝癌組織要高相吻合。這一現(xiàn)象可能與肝癌的發(fā)生過(guò)程中激發(fā)了多個(gè)信號(hào)通路有關(guān)，從而使這一潛在的癌基因得以擴(kuò)增及轉(zhuǎn)移，但這一癌基因是如何被激發(fā)的，有哪些信號(hào)通路得以表達(dá)仍需要作進(jìn)一步檢測(cè)。在證實(shí)MTDH在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)的同時(shí)，Wnt5b在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，正常組織中的Wnt5b表達(dá)明顯高于肝癌組織，在某種程度上，我們可以認(rèn)為它對(duì)肝癌的細(xì)胞的異常增殖、遷移起到阻止作用，而這種阻止行為在某種程度上引起自身的消亡。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)MTDH和Wnt5b的表達(dá)水平還與腫瘤直徑密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)與陶鵬輝[10]認(rèn)為的MTDH和乙型肝炎HCC中的表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)相關(guān)性，但與腫瘤直徑存在相關(guān)性相一致，但這種相關(guān)性與MTDH和Wnt5b兩者之間的表達(dá)量是否有直接關(guān)系，未有證實(shí)。我們知道HBV病毒HBX蛋白在HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生中起關(guān)鍵性的作用，該蛋白廣泛參與了RAS/RAF/MAPK、Wnt/β -catenin、PI3K/AKT/ERK、JAK/STAT等信號(hào)通路及其下游分子 cyclin D、A、B、P21 cip1、GSK-3β等的功能調(diào)控[20]。所有這些結(jié)果均提示我們MTDH和Wnt5b可以被用來(lái)對(duì)HBV相關(guān)性HCC進(jìn)行早期診斷、準(zhǔn)確分期診斷，它們作為兩個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)患者用藥提供參考，MTDH與Wnt5b的表達(dá)存在明顯不同，但MTDH和Wnt5b與HBV病毒之間的關(guān)系依然不明了，在MTDH異常增殖時(shí)，Wnt5b是否起到保護(hù)及延緩肝癌細(xì)胞的擴(kuò)增，遷移，在此次研究中還未得到相關(guān)的實(shí)驗(yàn)論證，這需要作進(jìn)一步的后續(xù)研究。