韓艷茹，賈奎，趙福成

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺血性卒中是因多種病因造成腦動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)興奮性毒性、線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥、離子失衡及酸中毒，最終導(dǎo)致腦組織不可逆性損傷，神經(jīng)細(xì)胞壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能及認(rèn)知功能缺失[1，2]。缺血所引起的腦組織損傷是致死性疾病的主要原因，是全世界第三大致死疾病之一，具有高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[3，4]。其中，缺血再灌注損傷發(fā)生在急性腦梗死恢復(fù)血液供應(yīng)后，重新獲得血液供應(yīng)的腦組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞死亡增多，腦組織損傷加重。近些年來(lái)，許多中藥被發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注早期可緩解腦組織損傷情況，并可減少海馬細(xì)胞的死亡[5，6]。因此，本研究旨在探究清腦益元湯大鼠腦梗死缺血再灌注中的主要作用機(jī)制，及對(duì)腦內(nèi)HIF-1α、VEGF、PDGF調(diào)節(jié)情況。

1 材料與方法

1.1 大鼠MACO模型制備[7]45只成年雄性Wistar大鼠SPF級(jí) （購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。相對(duì)濕度40%～70%，晝夜12h循環(huán)光照，溫度適宜。將SD大鼠按設(shè)計(jì)方案分成組，每組3組，每組15只；隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、清腦益元湯組。采用灌胃方法在造模后分別灌注14d等劑量的生理鹽水或清腦益元湯。采用10%水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉（35mg/kg），仰臥位固定大鼠，切開(kāi)皮膚病分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在CCA遠(yuǎn)心端近心端及ECA處掛線備用。用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎 CCA、ECA。然后在距 CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開(kāi)始算距離，當(dāng)插入深度在18mm時(shí)，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線。栓塞1h后，打開(kāi)栓塞制作再灌注模型。做完模型后，終止麻醉，將所有大鼠歸放籠里。

清腦益元湯：水牛角30g、水蛭 8g、赤芍 15g、參三七 10g、川牛膝 15g、紫河車 15g、紅景天 20g、干地黃10g、制首烏10g、肉蓯蓉10g。煎藥直至其變?yōu)楦酄?，藥物濃度含生?g/ml。大鼠按照3ml/100g清腦益元湯灌胃14d，對(duì)照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.2 大鼠Longa評(píng)分[8]動(dòng)物蘇醒后，參照Longa等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分為模型成功，0分和4分予以剔除，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)足每組動(dòng)物數(shù)。

1.3 采樣與指標(biāo)檢測(cè) 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，留取大腦海馬組織，中性福爾馬林（10%）固定，常規(guī)組織脫水和浸蠟包埋，石蠟5μm/張切片連續(xù)6張，切片用于HE染色和TTC檢測(cè)觀察腦組織形態(tài)變化和顏色變化，計(jì)算梗死面積。

1.4 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 離心大鼠腦組織提取海馬區(qū)蛋白，調(diào)整每一組的蛋白濃度總量為30ug/uL。各組蛋白樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，加入大鼠多克隆抗體 HIF－1α、VEGF、PDGF和二抗。顯色使用 ECL顯色劑，成像使用Bio－Pro凝膠成像分析儀，各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量用Quantity－one軟件進(jìn)行分析。

1.5 Real－Time PCR 法檢測(cè)基因表達(dá) Trizol法提取大鼠腦組織內(nèi)總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量Real－time PCR分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)HIF－1α、VEGF、PDGF至少重復(fù)3次。 分析：通過(guò)計(jì)算 HIF－1α、VEGF、PDGF 得到循環(huán)閾值CT值來(lái)確定基因的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)各組數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件處理，對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和Bonferroni "s Multiple Comparison Test進(jìn)行組間差異比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果 對(duì)照組大鼠腦組織呈均勻紅色，未見(jiàn)蒼白缺血區(qū)；模型組損傷腦組織可見(jiàn)蒼白梗死灶，且缺血灶范圍隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而擴(kuò)大；清腦益元湯組大鼠腦組織缺血面積明顯減少。與對(duì)照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠Longa評(píng)分明顯增高，梗死面積（%）明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 與模型組相比，清腦益元湯組大鼠Longa評(píng)分明顯降低，梗死面積（%）明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 大鼠神經(jīng)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

2.2 HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠腦海馬回神經(jīng)細(xì)胞胞膜、核膜清晰，核仁明顯細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常。模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞，多無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈不同程度的缺血性壞死，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃縮集聚，甚至形成核碎片，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈簇樣增生。清腦益元湯組缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞腫脹程度、間隙及細(xì)胞核改變均較輕，腦缺血區(qū)僅有輕、中度缺血性改變，缺血區(qū)腦梗死現(xiàn)象明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF－1、VEGF、PDGF的蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組HIF－1蛋白含量明顯降低，VEGF、PDGF蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖 2。

圖1 HE染色結(jié)果(400×)

圖2 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF的蛋白表達(dá)含量

2.4 Real-Time PCR法檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組 HIF-1 mRNA含量明顯降低，VEGF、PDGF mRNA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。 見(jiàn)圖 3。

圖3 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA表達(dá)水平

3 討論

中醫(yī)藥現(xiàn)如今在干預(yù)和治療腦組織疾病中具有顯著療效，不僅可以活血化瘀、解毒清腦，幫助機(jī)體恢復(fù)腦內(nèi)血流量，改善腦缺血損傷的局部微環(huán)境，改善腦缺血損傷程度；還可以益腎填精、補(bǔ)腎生髓，用于修復(fù)和改善缺血壞死的腦神經(jīng)元，降低神經(jīng)功能缺損。清腦益元湯由水牛角、水蛭、赤芍、參三七、川牛膝、紫河車、紅景天、干地黃、制首烏、肉蓯蓉10味中藥組成，水牛角清熱涼血解毒；水蛭破血逐瘀、活血通絡(luò)；赤芍清熱涼血；參三七活血化瘀；川牛膝活血通經(jīng)絡(luò)；紅景天活血化瘀、健脾益氣；紫河車補(bǔ)腎益精、補(bǔ)氣益血；地黃、制首烏及肉蓯蓉填精益髓益腎固元，功效為清腦祛瘀、益腎生髓，使腦絡(luò)通暢，局部血液供應(yīng)改善，梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損加速修復(fù)，擬用于腦缺血損傷大鼠急性期和恢復(fù)早期階段的防治[9-11]。

HIF-1α是機(jī)體在低氧狀態(tài)下做出適應(yīng)性反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)性因子。缺氧時(shí)HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β聚合成HIF-1，HIF-1與血管內(nèi)皮因子結(jié)合介導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，激活相關(guān)的缺血缺氧轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)受損腦組織中新生血管生成[12，13]。 同時(shí)，HIF-1α可參與介導(dǎo)顱腦損傷中的神經(jīng)元凋亡作用。HIF-1α是一種用于檢測(cè)低氧環(huán)境的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在顱腦損傷所致的缺血缺氧腦損傷發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中HIF-1α發(fā)揮著十分重要的作用。在發(fā)生了腦缺血損傷后，相比于損傷發(fā)生之前，大腦內(nèi)VEGF的表達(dá)顯著的提高[14]。VEGF作為目前最強(qiáng)的血管通透因子，通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管的通透性，能夠被激活或者直接促進(jìn)血管的生成，研究表明VEGF能夠提高機(jī)體腦組織內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的存活和促進(jìn)細(xì)胞增殖[15，16]。血小板衍生因子（PDGF）在結(jié)締組織細(xì)胞參與傷口愈合時(shí)表達(dá)明顯升高，PDGF通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的合成和分泌，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原蛋白的形成，可以大大降低傷口愈合的時(shí)間。國(guó)內(nèi)外研究表明，PDGF及其受體能夠促進(jìn)毛細(xì)血管壁的形成和穩(wěn)定，促進(jìn)血管生成和血管重建，并可通過(guò)促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，能對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，緩解腦部損傷[17，18]。

本研究結(jié)果表明，清腦益元湯可以有效緩解Longa評(píng)分，并可以有效改善大鼠的行為學(xué)變化，減輕大鼠腦組織腦缺血損傷情況，改善損傷海馬區(qū)不同程度的缺血性壞死和神經(jīng)元損傷。清腦益元湯能夠顯著降低大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α含量表達(dá)，并促進(jìn)VEGF、PDGF mRNA和蛋白含量表達(dá)以改善大鼠腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)腦內(nèi)新生血管生成，保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元。綜上所述，清腦益元湯對(duì)腦損傷大鼠的治療作用可為腦梗死的臨床治療提供新的理論依據(jù)、可能思路和靶向藥物。