李繼紅，王小莉，霍吉爾，吳秀明

(1.吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000；2.張家界市人民醫(yī)院呼吸內科，湖南 張家界 427000)

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)學“藏象學說”中的重要理論，認為肺與大腸通過經(jīng)脈的互為絡屬而構成表里關系，在功能上相互聯(lián)系，在病變上揭示了人體臟腑之間相互影響、相互作用的關系[1-2].支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道高反應性和氣道炎癥為主要特征并反復發(fā)作的呼吸道常見疾病.近年來，腸道功能與哮喘的相互關系研究很受關注[3-4].中醫(yī)學理論認為，哮喘可因肺失肅降和氣機潴滯而影響大腸的傳導功能，導致腑氣不通.另外,腸腑滯實，以致濁氣不降而上逆，進而影響肺的肅降功能，加重哮喘發(fā)病[5].研究表明，腸道細菌不同類群的構成與嬰幼兒的過敏易感性增強和哮喘發(fā)生有關[6-7]，提示哮喘發(fā)病與腸道功能存在相互影響、相互作用的關系，但探究肺與腸道之間共同粘膜免疫物質聯(lián)系的研究較少，哮喘發(fā)病時肺與大腸相關性的物質基礎尚不明確，具體發(fā)病機制仍不明確.筆者以大承氣湯通腸利肺作用為切入點，在大承氣湯方藥干預下，觀察哮喘及肺腸合病大鼠動物模型肺與大腸之間共同免疫物質TH17/Treg的變化，從而探討“肺與大腸相表里”的免疫機制.

1 材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠75只，SPF級，體質量(180±20)g.購自成都達碩生物科技有限公司，物合格證號：scxk(m)2008-15.

1.2 藥物及試劑

1%卵清蛋白(OVA，Sigma產(chǎn)品)；氫氧化鋁(成都市科龍化工試劑廠，批號20080807)；復方地芬諾酯片(焦作市博愛藥業(yè)有限公司，批號09033001).

1.3 儀器及設備

稱重天平(ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開發(fā)有限公司)；超聲霧化器(WH-203型，廣州粵華醫(yī)療器械有限公司).

2 方法

2.1 建立哮喘組/肺腸合病組/大承氣湯干預組哮喘動物模型

將75只大鼠隨機分為對照組(A)、哮喘組(B)、肺腸合病組(過敏性哮喘合便秘) (C)、大承氣湯哮喘干預組(哮喘干預組)(D)與大承氣湯肺腸合病干預組(肺腸合病干預組)(E)5組，每組大鼠15只.

(1)哮喘組.將1 mg OVA和200 mg氫氧化鋁溶于1 mL生理鹽水中,配制成新鮮的凝膠致敏劑,分別于第1天和第7天在大鼠雙側胸部及腹股溝4點皮下注射各0.15 mL,同時腹腔注射0.4 mL,共計1 mL進行致敏. 第14天開始將大鼠置于有機玻璃盒內,超聲霧化吸入1% OVA誘發(fā)哮喘,每天1次,每次30 min,共計1周,以大鼠出現(xiàn)煩躁、打噴嚏、咳嗽、腹肌強烈收縮、呼吸急促等典型哮喘樣發(fā)作癥狀為標準.對照組給予生理鹽水.

(2)肺腸合病組.灌胃給予復方地芬諾酯(劑量10 mg/kg),隔天1次.同樣,第1天和第7天注射上述致敏劑,第14天開始霧化,具體方法同哮喘組.以糞便干燥、粒形縮短、排出費力，日排出量低于正常參考值范圍(4.28～11.18 g) 為診斷大鼠便秘的標準[8].

(3)大承氣湯哮喘干預組(哮喘干預組)：15只大鼠同哮喘組處理，大鼠每次激發(fā)前30 min以大承氣湯灌胃，連續(xù)7天.

(4)大承氣湯肺腸合病干預組(肺腸合病干預組)：15只大鼠同肺腸合病組處理，大鼠每次激發(fā)前30 min以大承氣湯灌胃，連續(xù)7天.

2.2 觀察各組大鼠及其體內Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)

用免疫磁珠法分別提取大鼠外周血淋巴細胞，CD4+CD25+Foxp3+標記Treg細胞，CD4+抗IL-17A +標記Th17細胞，用流式細胞術測定2種細胞的數(shù)量與比例.用ELISA法檢測外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2的水平.

3 結果

3.1 各組肺組織的病理切片(HE)染色

正常對照組氣道結構清晰，氣道內未見粘液分布及粘液栓形成；氣道纖毛上皮排列整齊，粘膜皺襞無水腫，無明顯的炎癥及膠原纖維沉積.哮喘組及肺腸合病組大鼠支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤；肺間質及肺泡中可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤；氣道上皮損傷，結構紊亂，氣道內杯狀細胞肥大增生；氣道內分泌大量粘液，粘液栓形成，粘膜下膠原纖維沉積，氣道平滑肌細胞增生.大承氣湯干預后，哮喘干預組與肺腸合病干預組大鼠氣管及血管周圍炎性細胞浸潤程度明顯減輕，氣道內分泌物減少，粘膜下膠原纖維沉積與氣道平滑肌細胞增生減輕.

圖1 大鼠肺組織的病理切片(HE)染色Fig. 1 Pathological Section of Rat Lung Tissue (HE) Staining

3.2 Th17/Treg亞群分布測定

流式細胞術檢測結果如圖2所示.由圖2可知：與對照組(A)比較，哮喘組(B)及肺腸合病組(C)大鼠外周血淋巴細胞中Th17細胞比例升高，Treg細胞比例降低，且肺腸合病組(C)大鼠更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).在大承氣湯干預下，哮喘干預組(D)與肺腸合病干預組(E)Th17細胞比例降低，Treg細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

圖2 大鼠外周血淋巴細胞中Th17細胞比例與Treg細胞比例Fig. 2 Proportion of Th17/Treg in Lymphocytes of Rat Serum

3.3 外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2水平

實驗結果如圖3所示.由圖3可知：與對照組(A)及大承氣湯組干預(D，E)比較，哮喘組(B)及肺腸合病組(C)大鼠血清中IL-6,IL-17水平升高，IL-2水平降低；肺腸合病組(C)大鼠血清中IL-6，IL-17水平升高，IL-2水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).與哮喘組(B)及肺腸合病組(C)比較，哮喘干預組(D)與肺腸合病干預組(E)血清中IL-6，IL-17水平下降,IL-2水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

圖3 大鼠血清中IL-17，IL-6，IL-2水平Fig. 3 Levels of IL-17, IL-6, and IL-2 in Rat Peripheral Blood

4 討論

Th17/Treg 細胞失衡是哮喘發(fā)病的重要原因，也是目前研究的熱點[9-10].Th17細胞及IL-17與哮喘關系密切,哮喘患者的血清、肺泡灌洗液及支氣管活檢免疫組化均表明IL-17和(或)IL-17 mRNA增加,并且與患者氣道高反應性的嚴重程度相關[11].在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)，與哮喘組大鼠相比較，肺腸合病組大鼠支氣管肺組織中炎癥細胞浸潤明顯，外周血中Th17細胞升高比例與Treg細胞降低比例較哮喘組更明顯.血清IL-17，IL-6水平明顯增加，提示在哮喘發(fā)病，尤其是當腸道菌群及其功能變化導致腸道的微生態(tài)及其免疫變化時,大量的細菌穿過腸道粘膜，進一步激發(fā)T細胞，T17和Treg的分化失衡，免疫反應向呼吸道粘膜等部位遷移,在粘膜淋巴細胞的“歸巢”作用下，呼吸道產(chǎn)生強而廣泛的粘膜免疫應答，誘發(fā)機體免疫紊亂，使得支氣管哮喘的炎癥反應得以發(fā)生、發(fā)展以致加重.

筆者認為，肺腸合治需調節(jié)肺腸氣機的升降平衡，大承氣湯可宣發(fā)肺之肅降，承順大腸腑之氣.現(xiàn)代藥理研究認為大承氣湯具有顯著的抗炎、抗菌、解熱、抗氧化、提高機體免疫力，抑制內毒素產(chǎn)生致炎因子，通腑保肺等作用.本實驗中，在大承氣湯干預下，哮喘干預組和肺腸合病干預組Th17細胞比例明顯降低，Treg細胞比例升高，IL-6，IL-17水平下降，IL-2水平升高，提示大承氣湯通過調節(jié)哮喘發(fā)病中的TH17/Treg平衡來調節(jié)各種細胞因子，控制體內炎癥反應，調節(jié)肺腸氣機的升降平衡，宣肺(升清)通腑(降濁)，升降臟腑氣機的出入，以順應肺主宣發(fā)肅降，促邪外出，調整肺腸氣機清濁升降逆亂，使痰飲積滯得以降泄，從而有利于恢復肺之宣肅功能，是治療哮喘發(fā)作的一種有效方法.

筆者以大承氣湯通腸利肺作用為切入點，研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)病可影響腸道TH17/Treg的變化，腸道功能紊亂也可反過來影響到哮喘發(fā)病，大承氣湯通過調節(jié)TH17/Treg的免疫作用，提高黏膜屏障功能，降低淋巴細胞的“歸巢”作用，減輕哮喘發(fā)病.總而言之，本研究結論可為肺腸合病相關理論的分子機制研究提供了一條可行的途徑，為哮喘的整體治療提供實驗依據(jù).