李學(xué)斌，高 蕾，關(guān)美芝，李 曉

1.烏魯木齊高鑫博淵生物科技有限公司，烏魯木齊 830031 2.烏魯木齊市第十八小學(xué)，烏魯木齊 830006 3.烏魯木齊市公安局天山分局，烏魯木齊 830002

阿魏側(cè)耳（Pleurotus ferulae）因野生寄生或腐生在中藥阿魏（Ferula sinkianensis）肥大的根莖部，而得俗名阿魏菇[1]。在我國(guó)主要分布在新疆。阿魏菇具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，子實(shí)體分化溫度在0 ～15℃，生長(zhǎng)溫度6 ～18℃，新疆每年夏季6 月中旬到8 月底，由于氣溫較高，阿魏菇生長(zhǎng)停滯。

電激法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激孔”（Electroporation），形成可逆的瞬間通道，促進(jìn)外源DNA 的攝取。自1979 年Zimmerann發(fā)明該法以來(lái)，經(jīng)過(guò)多年的研究和改進(jìn)，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究[2]。1991年，Royer JC等首先采用電激法把編碼二氫乳清酸脫酶基因URA1導(dǎo)入同源的楊樹(shù)菇營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株中，獲得正常表達(dá)的楊樹(shù)菇[3]，接著雙孢蘑菇、糙皮側(cè)耳等也用該法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化子[4，5，6，7]。

采用電激轉(zhuǎn)化法，將未帶標(biāo)記的平菇（伏夏200）糙皮側(cè)耳總基因組DNA 通過(guò)電機(jī)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入阿魏菇原生質(zhì)體，采用臨界溫度篩選轉(zhuǎn)化子，獲得了生長(zhǎng)速度快、不需低溫刺激仍能正常出菇的高溫型阿魏菇新品種。本方法沒(méi)有化學(xué)物質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體的傷害，操作簡(jiǎn)單方便，遺傳轉(zhuǎn)化效率較高。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

糙皮側(cè)耳(P.ostreatus）伏夏200 由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。菌蓋直徑4～9 cm，菌蓋邊緣較圓整，出菇溫度為0～32℃，轉(zhuǎn)潮快，產(chǎn)量高，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率100%。

受體：新疆阿魏側(cè)耳（K8，實(shí)驗(yàn)編號(hào)：NB）原生質(zhì)體。

阿魏側(cè)耳（P.ferulae）K8 為新疆的主栽品種，子實(shí)體叢生，側(cè)耳狀(直徑 6～13 cm，厚1～6 cm)，白色，菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20～26 色，出菇（子實(shí)體生長(zhǎng)）溫度8～16 菇，轉(zhuǎn)化率26%，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基: 20 g葡萄糖，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，18 g瓊脂。

PDA液體培養(yǎng)基

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：250 g 土豆，10 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，205.4 g 蔗糖（0.6 mol/L ），去離子水1 L。

復(fù)蘇培養(yǎng)基：稱取蔗糖，加去離子水至終濃度為0.6 mol/L。

栽培料：62.79%棉籽殼、18%玉米粉、10%麩皮、6%油渣、1%糖、1%石膏粉、1%石灰粉、0.2%阿魏根粉、0.01%磷酸二氫鉀。

穩(wěn)滲劑：CPW+9%甘露醇。

離析酶5%，纖維素酶10%，蝸牛酶10%均購(gòu)自上海生工。

1.3 菌絲培養(yǎng)

阿魏側(cè)耳、糙皮側(cè)耳接種到PDA 平板中[8]，在20 ℃靜置培養(yǎng)5d，收集菌體0.1 g備用。

1.4 原生質(zhì)體制備及純化

阿魏側(cè)耳1 塊菌種塊（直徑0.5 cm）接種于裝有50 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，20 ℃靜置培養(yǎng)5 d。菌絲用四層紗布過(guò)濾并用大量無(wú)菌水沖洗。取100 mg 置于滅菌的1.5 mL 離心管中，加入1 mL 酶解液（1%纖維素酶和0.5%蝸牛酶），用滅菌的竹簽將菌絲稍稍剝離分開(kāi)，使其與酶解液充分混勻，置于30 ℃水浴中2.5～3 h，涂片鏡檢，待原生質(zhì)數(shù)量達(dá)到105～106個(gè)時(shí)即成為實(shí)驗(yàn)用原生質(zhì)體。用裝有無(wú)菌紗布的注射器過(guò)濾原生質(zhì)體液，去除殘留菌絲和雜質(zhì)后，5 000 r/min 離心10 min 以去除酶解液，將原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑（0.6 mol/mL 的蔗糖）洗滌2 次后，懸浮，即得到純化的原生質(zhì)體[9]。

1.5 糙皮側(cè)耳伏夏200總DNA提取

稱取糙皮側(cè)耳子實(shí)體放入已冷凍的研缽中，加入2%的PVP，倒入一些液氮，研磨材料，然后加入1mL CTAB[含50 μL DTT（1 Mol/L）]混合，再倒入已加入100 μL 氯仿/辛醇的EP 管中，65 ℃水浴30 min，室溫放置15 min 后，再加氯仿/辛醇到1.5 mL，輕輕混勻，13000 rpm離心7 min。取上清液放入干凈EP 管中，加入冰的無(wú)水乙醇0.5 mL,-20 ℃靜置，待出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)，13 000 rpm 離心7 min，棄上清液。75%酒精/ 0.2 M NaAc 1mL洗滌沉淀2 次，醇揮發(fā)后加入無(wú)菌水和RNA 酶，溶解，-20 ℃保存。用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA 的純度。用分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行紫外掃描，測(cè)260 nm、280 nm的吸收值，計(jì)算出DNA的濃度，最后用無(wú)菌水將DNA濃度稀釋到1 μg/μL備用[10]。

1.6 電擊轉(zhuǎn)化

采用ECM 630 電激系統(tǒng)，預(yù)置電壓，電激緩沖液為1 mol/L 的山梨醇。電激前將純化的原生質(zhì)體42 ℃浮浴5 min，再向低溫處理過(guò)的2 mL電激杯加入360 μL 的樣品和24 μL 糙皮側(cè)耳DNA 進(jìn)行電激，冰浴靜置 10～15 min 后，，接種在裝有3 mL 復(fù)蘇液體培養(yǎng)基的三角瓶中，80 r/min震蕩培養(yǎng)3 d。取600 μL 接種于PDA 平板上，涂布均勻，32 ℃（受體出發(fā)菌株菌絲停止生長(zhǎng)甚至死亡）下靜置培養(yǎng)，隨時(shí)觀察并挑取單菌落。

1.7 再生菌株篩選

將1.6挑取得單菌落和1.4制備的原生質(zhì)體接種在PDA 平板上，32 ℃下靜置培養(yǎng)5 d。測(cè)定生長(zhǎng)速度，選擇生長(zhǎng)速度明顯高于出發(fā)菌株者的再進(jìn)行出菇復(fù)篩。以出發(fā)菌株K8 和伏夏200 為對(duì)照。培養(yǎng)6～7 d，分別對(duì)單菌落進(jìn)行鏡檢。

1.8 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

分別選取10個(gè)純合耐高溫和10個(gè)純合低溫型的菌種DNA，分別等量混合構(gòu)建耐高溫池和低溫池，用于篩選與耐高溫基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。利用P.ostreatus基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)有多態(tài)的STS標(biāo)記STS-GX1(F:5′-CTCGACCAAAGATTCGCTGG-3′,R: 5′-TGGTGCCATATCAACTGGGT-3′)，STS 標(biāo)記對(duì)1.7篩選出的再生菌株進(jìn)行驗(yàn)證。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，來(lái)驗(yàn)證耐高溫的轉(zhuǎn)化子。

1.9 轉(zhuǎn)化菌株出菇試驗(yàn)

以生物轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體的商品性狀（色、菇形、菇質(zhì)）與出發(fā)菌株對(duì)比，篩選出生物轉(zhuǎn)化率明顯提高，并且商品性能同于或優(yōu)于出發(fā)菌株者確定為優(yōu)良菌株。栽培條件：

1.9.1 溫度

菌絲在5～32 在均可生長(zhǎng)，以24～26 生為最佳。子實(shí)體生長(zhǎng)溫度14～26 佳，最適溫度為16～24適。

1.9.2 濕度和水分

菌絲體和子實(shí)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育需要大量水分。菌絲生長(zhǎng)期培養(yǎng)基質(zhì)含水量60%～65%，以62.5%為最佳，料水比為1：1.3～1.5，子實(shí)體在空氣相對(duì)濕度85%～95%時(shí)，能夠正常發(fā)育生長(zhǎng)。

1.9.3 空氣

阿魏側(cè)耳菌絲對(duì)二氧化碳有較高的耐受性，種植耐高溫型阿魏菇新品種（＜＜農(nóng)作物品種登記合格證＞＞新農(nóng)登字［2015］第58 號(hào)，品種名稱：高鑫1828），通氣量要大于常規(guī)阿魏菇一倍以上，子實(shí)體才能正常分化、生長(zhǎng)出優(yōu)質(zhì)菇。

1.9.4 光照

菌絲體生長(zhǎng)無(wú)需光線，但原基的分化和子實(shí)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育需要一定的散射光刺激。耐高溫型阿魏側(cè)耳新品種（高鑫1828）散射光照強(qiáng)度在600～1 200lux子實(shí)體才能正常生長(zhǎng)發(fā)育。

1.9.5 酸堿度

阿魏菇菌絲在酸性過(guò)強(qiáng)（pH4 以下）的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到抑制。。在pH 值5～11 范圍內(nèi)，阿魏菇菌絲均能生長(zhǎng)。但最適pH值為6.5～7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化效率和驗(yàn)證

通過(guò)大量的電激轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，規(guī)模為1 過(guò)大量9～1過(guò)大量10個(gè)/mL.在32 ℃時(shí)，阿魏側(cè)耳K8及其原生質(zhì)體菌絲均不生長(zhǎng)甚至死亡，而供體伏夏200 能正常生長(zhǎng)，2 株再生菌株能夠生長(zhǎng)，電激轉(zhuǎn)化率為10%。得到生長(zhǎng)速度高于出發(fā)菌株的再生菌株K2株。

圖1 篩選出的轉(zhuǎn)化菌株

圖2 未轉(zhuǎn)化菌株（對(duì)照）

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和確定轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株在遺傳上的區(qū)別，研究利用分子生物學(xué)最新技術(shù)，分別設(shè)計(jì)了15對(duì)隨機(jī)引物，利用RAPD技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了隨機(jī)引物PCR 擴(kuò)增，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了電泳分析。結(jié)果表明，絕大多數(shù)存在營(yíng)養(yǎng)不親合菌株，其隨機(jī)引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物存在不同程度的差別。圖3為轉(zhuǎn)化菌株600-5與出發(fā)菌NB的RAPD 電泳圖，由圖可以看出其與出發(fā)菌存在多處不同。

圖3 出發(fā)菌株NB與轉(zhuǎn)化菌株RAPD電泳圖

圖4 轉(zhuǎn)化子菌株生長(zhǎng)速度柱狀圖

2.3 轉(zhuǎn)化子的鑒定

STS 標(biāo)記產(chǎn)物大小為231 bp，可用于檢測(cè)耐高溫的阿魏菇轉(zhuǎn)化子。研究結(jié)果表明3 為假陽(yáng)性，4～7為轉(zhuǎn)化子。

圖5 STS-GX1標(biāo)記對(duì)耐高溫轉(zhuǎn)化子的鑒定

2.4 復(fù)篩及轉(zhuǎn)化子的出菇試驗(yàn)：

表1 出菇試驗(yàn)對(duì)比

篩選的轉(zhuǎn)化菌株命名為阿魏菇（高鑫1828）。出菇試驗(yàn)結(jié)果表明：阿魏菇新種質(zhì)(高鑫1828)在常溫下（大棚室內(nèi)溫度白天25℃左右，夜間17℃左右）能正常出菇（見(jiàn)圖6）。農(nóng)藝性狀：子實(shí)體單生，白色，馬蹄形，直徑 10～15 cm，菌肉白色，厚 0.3～6 cm，出菇率100%，生物轉(zhuǎn)化率45%，高產(chǎn)，每個(gè)出菇袋兩頭各出1朵子實(shí)體，單朵重175～297 g，生長(zhǎng)周期短，出菇時(shí)間提前30 d，由120 d提前到90 d。

3 結(jié)論

原生質(zhì)體的制備是應(yīng)用原生質(zhì)體技術(shù)育種的前提。不同種類的食用菌其原生質(zhì)體制備的最佳條件不盡相同。制備細(xì)胞原生質(zhì)體時(shí)，必須有效地除去細(xì)胞壁，而影響原生質(zhì)體制備的因素很多，其中酶種類和濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、輕微振蕩等都是影響原生質(zhì)體釋放的因素，其中酶解液的往往被認(rèn)為最重要的因素。因此，本研究按照不同比例將幾種酶混合起來(lái)，以此來(lái)克服單一酶的缺陷性。

食用菌原生質(zhì)體的獲得，因其幾乎都是單細(xì)胞，而被廣泛用于細(xì)胞融合、突變、細(xì)胞篩選等育種工作。另外，原生質(zhì)體也是遺傳轉(zhuǎn)化的廣泛受體之一，在多種植物的基因改造中都被作為接受外源基因的良好受體，進(jìn)而從原生質(zhì)體著手進(jìn)行基因修飾已經(jīng)成為食用菌育種的有效途徑之一[11]。

電激轉(zhuǎn)化技術(shù)被證明是一種行之有效的食用菌育種新方法。電轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)改良食用真菌的性狀和創(chuàng)造新的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株具有明顯的優(yōu)勢(shì)。該方法突出優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高且操作簡(jiǎn)便快速，人為去除細(xì)胞壁，解除了菌株間物理上、生理上的主要屏障，因而使食用菌遠(yuǎn)緣雜交、相同交配型的雜交、及共生菌根菌的馴化栽培成為了可能。

本研究中選用四種穩(wěn)定滲透液配制酶解液：0.6 M 蔗糖，1 M 山梨醇，0.6 M 甘露醇，CPW+9%甘露醇，再生原生質(zhì)體分別涂布在再生培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，正常情況下，原生質(zhì)體不能在其上生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，用CPW+9%甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備酶解液，產(chǎn)生的原生質(zhì)體效果最佳，再生效率最高。電激轉(zhuǎn)化電壓設(shè)400 V，600 V，800 V，1000 V，1200 V，分別進(jìn)行電激實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在電壓600 V 下，電擊25 μF，在含0.8 mol/L蔗糖的再生培養(yǎng)基上，原生質(zhì)體再生時(shí)間16 d時(shí)，再生率可達(dá)0.6%。而電壓過(guò)低時(shí)，基因?qū)肼侍?；電壓過(guò)高時(shí)，又會(huì)使原生質(zhì)體死亡率過(guò)高。參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇再生率為0.6%的電壓600 V，電擊25 μF作為電擊的最佳條件。

食用菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)既有綜合不同食用菌遺傳信息的重組作用又有剖析基因組基因，轉(zhuǎn)移外源基因的分析作用，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中創(chuàng)造的食用菌新品種和對(duì)食用菌遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究都有十分重要的意義。

本研究獲得專利證書（專利名稱：電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，專利號(hào)：ZL 2011 1 0398232.3），并且培育出的阿魏菇新種質(zhì)（高鑫1828）已通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)非主要農(nóng)作物品種登記審定，獲得農(nóng)作物品種登記證書。