高加龍, 章超樺，秦小明，郝記明，張 靜，蘇偉明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江) // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 //廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室 // 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，包含重金屬在內(nèi)的各種污染物被源源不斷地排入海洋環(huán)境，這些重金屬，即使?jié)舛刃?，也可在藻類和底泥中積累，被魚和貝的體表吸附，產(chǎn)生食物鏈濃縮，從而造成公害。例如，汞（Hg）污染導(dǎo)致“水俁病”和鎘（Cd）污染導(dǎo)致“痛痛病”等。鎘是一種劇毒重金屬，能夠廣泛誘導(dǎo)環(huán)境中的生物體產(chǎn)生毒性反應(yīng)，其毒性包括干擾各種代謝過(guò)程、膜運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成、DNA修復(fù)以及活性氧（ROS）的產(chǎn)生等[1-3]?；钚匝醯姆e累會(huì)造成組織生物膜、蛋白質(zhì)及核酸的損傷。在正常生理學(xué)情況下，機(jī)體通過(guò)抗氧化防御機(jī)制防止活性氧的形成，通過(guò)清除活性氧修補(bǔ)損傷，限制活性氧產(chǎn)生的有害影響。抗氧化防御主要由過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等酶類抗氧化劑及維生素類抗氧化劑構(gòu)成[2,4]。目前針對(duì)貝類重金屬脅迫影響的研究，主要集中在毒理學(xué)、抗氧化酶活性、功能基因研究和DNA損傷等[5-6]。在雙殼類動(dòng)物中，環(huán)境污染可增強(qiáng)氧化應(yīng)激，從而干擾天然抗氧化酶系統(tǒng)。研究報(bào)道，鎘、汞、鰻弧菌和副溶血弧菌可誘導(dǎo)櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）、文蛤和貽貝等雙殼貝類中CAT、SOD的表達(dá)[7-9]。此外，熱休克蛋白 70（HSP70）是熱休克蛋白超家族的重要成員，具有細(xì)胞內(nèi)分子伴侶和細(xì)胞外免疫調(diào)節(jié)功能，是受到熱激、重金屬、干旱、疾病、寄生蟲感染等條件脅迫后產(chǎn)生的誘導(dǎo)蛋白[10]。

蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）是一種冷水性貝類，原產(chǎn)于日本北海道及本洲北部、俄羅斯千島群島的南部水域及朝鮮附近，目前已在渤海及黃海北部形成規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖，是我國(guó)北方最重要的海水養(yǎng)殖貝類之一。蝦夷扇貝易于蓄積重金屬，尤其是鎘[11]。然而，目前關(guān)于實(shí)驗(yàn)性金屬污染后蝦夷扇貝的生理反應(yīng)和解毒過(guò)程的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。因此，筆者以蝦夷扇貝為對(duì)象，研究在重金屬Cd脅迫下扇貝的生理指標(biāo)響應(yīng)及對(duì) Cd的富集特征，以期為蝦夷扇貝的健康養(yǎng)殖、棲息地環(huán)境監(jiān)測(cè)和海洋環(huán)境保護(hù)等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活蝦夷扇貝（M.yessoensis），殼長(zhǎng)（11.2 ±0.8）cm，購(gòu)自日本東京筑地水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

Trizol（Ambion公司，美國(guó)）；PrimeScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）、SYBR? Premix EX TaqTM II (Tli RNaseH Plus) Kit（Takara 公司，日本)；CdCl2·2.5H2O為分析純；硝酸、高氯酸為優(yōu)級(jí)純；鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；Ultra Clam貝類飼料（Fauna Marin公司，德國(guó)）。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7300 Real Time PCR System、ABI 3130 Genetic Analyser（Applied Biosystems公司，美國(guó)）；Biospec-nono 紫外分光光度計(jì)（島津公司，日本）；Thermo SOLAAR M6原子吸收分光光度計(jì)（Thermofisher公司，美國(guó)）；C-MAG HP10電加熱板（IKA公司，德國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 扇貝暫養(yǎng)及重金屬暴露 購(gòu)買的鮮活扇貝先在實(shí)驗(yàn)室的水族箱（90 cm × 45 cm × 45 cm）中用人工海水暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)后隨機(jī)分為3組，每組20只，1組作為對(duì)照組（Control），在不添加重金屬的海水中飼養(yǎng)10 d；另2組分別在添加了200和400 μg/L CdCl2的人工海水中暴露10 d，每天完全換水并添加Cd至對(duì)應(yīng)濃度。在暫養(yǎng)和暴露實(shí)驗(yàn)階段海水溫度均控制在（18 ± 1）℃，自然光照周期，供氧泵持續(xù)曝氣，每天在海水中添加0.1 g/100 L的Ultra Clam作為飼料[12]。

1.3.2 扇貝組織收集 在暴露7 d和10 d后，分別從對(duì)照組和Cd處理組中隨機(jī)選擇5個(gè)扇貝。開(kāi)殼取內(nèi)臟團(tuán)，于液氮中速凍后在-80 ℃保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測(cè)定；同時(shí)收集扇貝其余內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌、腮和性腺組織，于-20 ℃保存，用于Cd含量測(cè)定。

1.3.3 扇貝鎘含量測(cè)定 為了減少取樣水分差異對(duì)測(cè)定結(jié)果造成的誤差，用于Cd含量測(cè)定的各組織預(yù)先在80 ℃干燥箱中干燥24 h以上。準(zhǔn)確稱量已干燥的扇貝各組織0.30 g，置于三角燒瓶中，加入20 mL的硝酸+高氯酸（體積比7∶1）的混合酸，放置12 h，然后在電熱板210 ℃加熱消解2～3 h，不時(shí)補(bǔ)加混合酸至完全消解，再持續(xù)加熱除酸后定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定[13]。

1.3.4 總 RNA提取和第一鏈 cDNA合成 采用Trizol法提取扇貝內(nèi)臟團(tuán)的總RNA，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性，用Biospec-nono紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各 RNA濃度及純度，參照PrimeScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）說(shuō)明書合成實(shí)時(shí)熒光定量PCR cDNA模板。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以β-actin基因作為內(nèi)參，cDNA為模板，ABI 7300 Real Time PCR進(jìn)行 qRT-PCR。引物見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系參考SYBR? Premix EX TaqTM II說(shuō)明書，20 μL 反應(yīng)體系：10 μL 2 × SYBR? Premix Ex Taq，2 μL cDNA模板, 0.4 nmol/mL 引物，0.4 μL 50 × ROX reference dye，擴(kuò)增程序?yàn)樵?5 ℃下變性30 s，然后在95 ℃下反應(yīng)5 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，進(jìn)行40次循環(huán)。為了評(píng)估PCR擴(kuò)增的特異性，在qPCR周期結(jié)束時(shí)，收集65～95 ℃的熒光數(shù)據(jù)，在0.5 ℃增量下進(jìn)行熔解曲線分析。最后用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 所有測(cè)試平行重復(fù)3次，結(jié)果以X±S表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較判斷組間差異的顯著性，顯著性水平為α= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝組織中鎘的分布

圖1 扇貝不同組織中鎘的含量Fig.1 Cd bioaccumulation in tissues of scallops

圖1是對(duì)照組的蝦夷扇貝不同組織中Cd的含量，其內(nèi)臟團(tuán)含有62 μg/g（干基）的Cd，各組織Cd濃度高低依次為內(nèi)臟團(tuán)＞ 腮＞外套膜＞ 性腺＞ 閉殼肌，內(nèi)臟團(tuán)中Cd濃度約為閉殼肌的108倍（P= 0.004）。與本研究結(jié)果相似的是，Evtushenko等[9]對(duì)日本海不同年齡的蝦夷扇貝中的 Cd進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1到8年齡扇貝內(nèi)臟團(tuán)中Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)從39 μg/g（干基）遞增到400 μg/g（干基），而腮、外套膜和閉殼肌中則低于6 μg/g（干基）。可見(jiàn)，作為濾食性動(dòng)物，扇貝可以大量富集環(huán)境中的Cd，且絕大多數(shù)Cd富集在內(nèi)臟團(tuán)中。因此，本研究選用扇貝內(nèi)臟團(tuán)作為對(duì)鎘富集特性及生理響應(yīng)的研究對(duì)象。

2.2 扇貝內(nèi)臟團(tuán)對(duì)鎘的富集

當(dāng)扇貝暴露在含有Cd的海水中，內(nèi)臟團(tuán)中Cd含量持續(xù)增加。暴露于400 μg/L Cd海水7 d和10 d后，扇貝內(nèi)臟團(tuán)中的Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)由62 μg/g（干基）分別增加到了180和217 μg/g（干基），約為對(duì)照組的3倍左右，且與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）（圖2）。研究報(bào)道，菲律賓蛤仔、近江牡蠣和翡翠貽貝在含100 μg/L Cd的海水中暴露18 d后，組織中Cd含量分別為對(duì)照的20、17和25倍[14]。與以上3種雙殼貝類相比，本研究中蝦夷扇貝Cd富集倍數(shù)相對(duì)較低的原因可能是暴露天數(shù)相對(duì)較短（10 d），也可能是成年扇貝已經(jīng)在棲息環(huán)境中富集了相對(duì)較高濃度的Cd（62 μg/g，干基）。

圖2 不同濃度鎘暴露下扇貝內(nèi)臟團(tuán)中鎘的富集Fig.2 Cadmium bioaccumulate in the digestive glands of scallops exposed to different concentrations of Cd

2.3 Cd暴露后扇貝內(nèi)臟團(tuán)誘導(dǎo)蛋白基因表達(dá)分析

越來(lái)越多的證據(jù)表明，鎘的積累通過(guò)過(guò)量產(chǎn)生ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)對(duì)生物體具有重大的負(fù)面影響[15]。為了研究鎘脅迫下扇貝內(nèi)臟團(tuán)的生理響應(yīng)，對(duì)扇貝內(nèi)臟團(tuán)中CAT、SOD、GPx和HSP70的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR分析。每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物（包括參比基因）的熔解曲線只有一個(gè)峰，經(jīng)瓊脂糖電泳和ABI 3130 Genetic Analyser測(cè)序證實(shí)為目的產(chǎn)物，且β-actin mRNA的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)期間基本穩(wěn)定。

圖3可見(jiàn)，Cd處理可誘導(dǎo)扇貝內(nèi)臟團(tuán)CATmRNA的表達(dá)。在含200 μg/L Cd的海水中暴露7 d后CAT的表達(dá)水平顯著升高，10 d后表達(dá)量則顯著回落，7 d后的表達(dá)量高于10 d后和對(duì)照組的5倍（P＜0.05）。而在含400 μg/L Cd的海水暴露時(shí)，CAT mRNA的表達(dá)在7 d后也明顯增加（P＜0.05)，但10 d后未見(jiàn)明顯下降（P＞ 0.05）。

圖3 鎘暴露下扇貝內(nèi)臟團(tuán)中CAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative mRNA expression of CAT in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

扇貝SODmRNA表達(dá)水平如圖4所示，在含200 μg/L Cd的海水中暴露7 d后表達(dá)量達(dá)的最高值，比對(duì)照組高28倍（P＜0.05），在10 d后表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）。而在含400 μg/L Cd的海水處理10 d前扇貝SODmRNA表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞ 0.05）。

圖4 鎘暴露下扇貝內(nèi)臟團(tuán)中SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative mRNA expression of SOD in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

在含200 μg/L Cd海水中暴露，蝦夷扇貝GPx的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。在暴露7 d和10 d后表達(dá)量上升（分別比對(duì)照組增加22倍和17倍）（圖5）。在含Cd 400 μg/L海水中暴露，也導(dǎo)致了蝦夷扇貝GPxmRNA在暴露7 d和10 d 后表達(dá)上升（分別比對(duì)照增加9和8倍)，但差異無(wú)顯著性（P＞ 0.05）。

圖5 鎘暴露下扇貝內(nèi)臟團(tuán)中GPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative mRNA expression of GPx in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

蝦夷扇貝HSP70基因表達(dá)如圖6所示， Cd暴露后扇貝HSP70mRNA表達(dá)水平升高，200 μg/L暴露7 d組呈顯著性差異（P＜0.05），400 μg/L的Cd暴露10 d后表達(dá)量達(dá)幾組中的最高值，比對(duì)照組高 26 倍（P＜0.05）。

圖6 鎘暴露下扇貝內(nèi)臟團(tuán)中HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative mRNA expression of HSP70 in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

3 討論

潮間帶濾食性無(wú)脊椎動(dòng)物在其組織，特別是在內(nèi)臟團(tuán)中積累高水平的微量金屬，。內(nèi)臟團(tuán)不僅僅是用于消化的組織，也是對(duì)外來(lái)危害物質(zhì)解毒和防御的組織[16]。因此，選擇內(nèi)臟團(tuán)來(lái)研究生物對(duì) Cd的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Cd暴露誘導(dǎo)扇貝內(nèi)臟團(tuán)中CAT表達(dá)顯著增加，說(shuō)明CAT在Cd的解毒和免疫應(yīng)答中起著重要作用，這在許多雙殼貝類的消化系統(tǒng)中得到了證實(shí)[17-18]。SOD存在于所有有氧細(xì)胞中，被認(rèn)為對(duì)活性氧的毒性起著重要的保護(hù)作用。SOD在無(wú)脊椎動(dòng)物中的表達(dá)可由熱刺激、重金屬暴露、微生物和有機(jī)污染物等各種挑戰(zhàn)誘導(dǎo)[8,19]。本研究中Cd誘導(dǎo)扇貝內(nèi)臟團(tuán)中SODmRNA的表達(dá)增加，提示SOD是保護(hù)生物體免受Cd毒害的抗氧化防御因子之一[20]。同樣，200 μg/L Cd誘導(dǎo)蝦夷扇貝GPx大量表達(dá)，說(shuō)明扇貝GPx也參與抗氧化防御。GPx通過(guò)催化與谷胱甘肽（GSH）的反應(yīng)去除H2O2，除了H2O2之外，該酶還催化其他氫過(guò)氧化物的還原，具有比過(guò)氧化氫酶更寬的保護(hù)范圍[21]。

Cd引起不同水平的生物系統(tǒng)的顯著代謝改變和損傷，以防止和修復(fù)鎘引起的細(xì)胞成分的損傷，對(duì) ROS的防御機(jī)制的損傷導(dǎo)致 ROS濃度的增加[22]。這一事實(shí)可以解釋Cd暴露后抗氧化酶CAT、SOD和GPx基因轉(zhuǎn)錄的增加。在本研究中，Cd處理對(duì)CAT、SOD和GPx的表達(dá)均有影響，在鎘濃度為200 μg/L時(shí)，暴露7 d時(shí)3種酶的mRNA表達(dá)均顯著增加，但無(wú)論Cd處理為400 μg/L或暴露于10 d時(shí)，3種酶的mRNA表達(dá)水平均卻顯著降低。類似的結(jié)果表明，CAT活性的變化是急性應(yīng)激期間對(duì)污染物的短暫反應(yīng)，但在慢性污染生物體中并不明顯[23]，可能是CAT、SOD和GPx參與了抗氧化損傷的一線防御[24]。高劑量Cd或長(zhǎng)期暴露會(huì)對(duì)扇貝造成危害，并造成不可修復(fù)的損害，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露高劑量Cd（400 μg/L）的扇貝死亡率相對(duì)較高。HSP70被稱為應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的經(jīng)典反應(yīng)蛋白，其含量高低對(duì)生物機(jī)體的損傷程度具有一定的指示作用[10]，當(dāng)機(jī)體遇到重金屬脅迫等刺激時(shí), HSP70 可通過(guò)防止蛋白的凝聚及變性, 維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定, 增強(qiáng)機(jī)體抗刺激及生存能力。本研究中扇貝在Cd脅迫下HSP70mRNA表達(dá)升高，在200 μg/L暴露7 d和400 μg/L暴露10 d條件下呈顯著差異，證實(shí)了這類蛋白在扇貝Cd暴露保護(hù)中起重要作用。然而扇貝中HSP70表達(dá)量與暴露時(shí)間和重金屬濃度并無(wú)線性關(guān)系，陳曉聰?shù)萚25]對(duì)菲律賓蛤仔的研究也出現(xiàn)相似結(jié)果，在2.5、5.0、7.5和10.0 μg/L汞中暴露后菲律賓蛤仔腮中HSP70mRNA表達(dá)量隨著暴露濃度增加呈先升高后降低最后又升高的趨勢(shì)，而在2.5和7.5 μg/L汞暴露48 h后mRNA表達(dá)量反而低于暴露24 h后的。

本研究是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬了扇貝的急性Cd脅迫效應(yīng)，能夠高效可控的探討貝類受毒性損傷的機(jī)理，可為扇貝的綜合利用開(kāi)發(fā)及海洋環(huán)境的生物修復(fù)提供一些理論依據(jù)。但實(shí)驗(yàn)室不能很好地模擬海域現(xiàn)場(chǎng)的溫度、鹽度和洋流特征等，而且在作用濃度和時(shí)間的設(shè)計(jì)上也很難模擬現(xiàn)場(chǎng)的情況，因此，今后考慮將實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)和海域現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查相結(jié)合，以便更真實(shí)反映海域現(xiàn)場(chǎng)的作用模式和毒性機(jī)理，更好指導(dǎo)貝類品質(zhì)的控制，減少貝類資源衰退及防治海洋環(huán)境污染。

4 結(jié)論

蝦夷扇貝各組織易于富集環(huán)境中的Cd，尤其內(nèi)臟團(tuán)，是富集重金屬的主要組織。隨著鎘暴露時(shí)間延長(zhǎng)，扇貝內(nèi)臟團(tuán)中Cd濃度急劇升高，內(nèi)臟團(tuán)中抗氧化酶CAT、SOD和GPx以及熱休克蛋白HSP70在Cd暴露后的基因表達(dá)量也顯著增加，說(shuō)明其對(duì)Cd暴露的扇貝具有防御和保護(hù)作用。