張 強(qiáng) 陳 軒 徐 亮

2型糖尿病(T2DM)是一種常見的、多發(fā)的內(nèi)分泌失代謝性性疾病，其發(fā)病環(huán)節(jié)主要是胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和胰島β細(xì)胞功能受損?，F(xiàn)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)、炎性反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病、IR和肥胖發(fā)生的重要途徑。胰高血糖樣肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是腸-胰島軸中控制T2DM最核心的介導(dǎo)因子，可抑制β細(xì)胞凋亡并促進(jìn)β細(xì)胞在體外和體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖[1]。艾塞那肽是第一個獲得FDA批準(zhǔn)用于臨床的短效GLP-1類似物類降糖藥[2]。

材料與方法

1.研究材料:小鼠INS-1細(xì)胞購自上海華拓生物有限公司；培養(yǎng)基(DMEM，1640)、平衡鹽溶液(PBS)、澳洲胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)或應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)抗體、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BiP)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、凋亡蛋白(caspase-3)、內(nèi)參(β-actin)購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司；RIPA裂解液、PMSF酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BSA封閉液、山羊抗鼠、山羊抗兔、MTT試劑盒、PVDF膜發(fā)光試劑盒(BeyoECL Plus)購于碧云天生物技術(shù)公司；JNK激動劑(Anisomycin)購于Selleck公司；艾塞那肽(Exendin-4)購于美國MCE公司。

2.細(xì)胞分組及培養(yǎng)：根據(jù)細(xì)胞生長情況，將對數(shù)期生長的INS-1細(xì)胞按不同的處理方式分為4組：對照組(A組，完全培養(yǎng)基)、高糖組(B組，30mmol/L高糖培養(yǎng)基)；高糖+100nmol/L艾塞那肽組(C組)；高糖+100nmol/L艾塞那肽+250ng/ml JNK激動劑(Anisomyci)組(D組)；完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基)，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔24h換液1次，高糖組采用間斷性高糖刺激(即30mmol/L高糖培養(yǎng)基與正常糖濃度培養(yǎng)基24h交替培養(yǎng))，C組培養(yǎng)(高糖+100nmol/L艾塞那肽與正常培養(yǎng)基+100nmol/L艾塞那肽24h交替培養(yǎng))，D組前5天培養(yǎng)為(高糖+100nmol/L艾塞那肽與正常培養(yǎng)基+100nmol/L艾塞那肽24h交替培養(yǎng))，最后2天加入250ng/ml JNK激動劑處理。培養(yǎng)7天后提取總蛋白，提取蛋白保存于-80℃冰箱備用。每天換液前，于500倍相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長情況。MTT法檢測細(xì)胞的活性，用酶標(biāo)儀檢測其在490nm波長下的吸光度值(A值)。

3.Western blot法檢測Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3蛋白的表達(dá)量：用預(yù)冷的PBS液洗細(xì)胞3次，吸盡PBS后，加入含1% PMSF酶抑制劑及1%磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液(RIPA)約400μl提取各組細(xì)胞總蛋白，離心(20000r/min 15min)去除沉淀，BCA測定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液煮沸(100℃ 5min)，取相同質(zhì)量的蛋白上樣，硫代硫酸鈉．聚丙烯酰胺(SDS．PAGE)凝膠電泳；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)，5%的BSA常溫下封閉1h，TBST洗膜3次(每次5min)，一抗(1∶1000)4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶1000)室溫孵育1h，TBST洗膜3次后，曝光顯影。利用圖像分析軟件Fusion對條帶進(jìn)行灰度值定量分析，用“目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比”代表靶蛋白的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1.顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長情況：與對照組比較，高糖組培養(yǎng)至第4天細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡，第6、7天死亡細(xì)胞較多；JNK激動劑組在激動劑刺激后出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，高糖+艾塞那肽組與對照組比較細(xì)胞存活狀態(tài)無明顯變化，詳見圖1。

2.MTT檢測各組細(xì)胞的活性：高糖組、JNK激動劑組細(xì)胞的吸光度與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高糖+艾塞那肽組細(xì)胞的吸光度與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組細(xì)胞的A值

3.各組細(xì)胞經(jīng)過不同處理7天后Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3蛋白的表達(dá)量。間歇性高糖刺激組上調(diào)Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3表達(dá)量，與對照組比較，分別增加1.70、1.21、1.12、1.15倍(P<0.05)；高糖+艾塞那肽組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高糖+艾塞那肽+激動劑組，上調(diào)P-SAPK/JNK、caspase-3表達(dá)量，與對照組比較，分別增加1.14、1.22倍(P<0.05)，Bip、CHOP與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 培養(yǎng)7天后各組蛋白質(zhì)的表達(dá)量

討 論

早期研究已經(jīng)證實T2DM的發(fā)病環(huán)節(jié)主要是胰島素抵抗(IR)和胰島β細(xì)胞功能受損，但確切機(jī)制尚未闡明。近年來有研究認(rèn)為炎性反應(yīng)在IR、T2DM和肥胖的發(fā)病中起重要作用。2004年Ozcan等[3]則提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是導(dǎo)致糖尿病、IR和肥胖發(fā)生的重要途徑。在肥胖小鼠模型中，檢測肝臟、脂肪和肌肉組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志分子，如雙鏈RNA依賴蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、翻譯起始因子2α(eIF2α)和c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化水平以及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(BiP)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，肝臟和脂肪組織中上述4種分子的磷酸化和mRNA水平均顯著增強(qiáng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，肌醇需求激酶-lα(IRE-lα)磷酸化增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子2的募集而激活JNK。由此提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過IRE-1α和JNK依賴的蛋白激酶級聯(lián)通路促進(jìn)胰島素受體底物(IRS-1)的絲氨酸磷酸化，進(jìn)而影響胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)由末段回腸和結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌L細(xì)胞產(chǎn)生。其生物活性主要包括促進(jìn)胰島素的分泌、改善胰島素對血糖的敏感度、抑制胰高血糖素的分泌、保護(hù)胰島細(xì)胞，減少胰島細(xì)胞的凋亡、抑制胃排空和胃酸的分泌等[4～6]。有研究表明，2型糖尿病患者血液中的GLP-1量及效應(yīng)明顯低于正?；颊遊7]。在體外試驗中，Exendin-4通過抑制IRE1-JNK-caspase-3信號通路減少叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡，GLP-1還通過抑制 NF-κB信號通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷[8，9]。

本研究結(jié)果顯示，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性相關(guān)信號分子CHOP和BiP蛋白在高糖刺激組有高表達(dá)，而高糖+艾塞那肽組CHOP和BiP蛋白相對于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，揭示了高糖可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而艾塞那肽可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。高糖+艾塞那肽+JNK激動劑組通過艾塞那肽抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,相比于B組下調(diào)CHOP及BiP的表達(dá)量下調(diào)，同時JNK激動劑激活JNK信號通路上調(diào)P-SAPK/JNK及特異性凋亡信號分子caspase-3表達(dá)量，同時相對于對照組，高糖刺激組P-SAPK/JNK表達(dá)上調(diào)，揭示了通過高糖的刺激可能與JNK信號通路有關(guān)。多項研究表明，β細(xì)胞是對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最為敏感的組織之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡是糖尿病發(fā)病的重要機(jī)制[10]。Wang等[11～14]研究發(fā)現(xiàn)長期高糖處理可引起大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征性標(biāo)志分子如CHOP和BiP表達(dá)增加，推測長期高糖通過引起蛋白質(zhì)合成的過度負(fù)荷導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

綜上所述，GLP-1類似物艾塞那肽可通過抑制高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制JNK信號通路，保護(hù)胰島細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療T2DM的效果。