李若曦，方洪楓，王國紅，楊民和，2

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108；2.工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108）

【研究意義】黑茶制作過程中的渥堆工藝是形成黑茶獨特品質的關鍵步驟［1］。在渥堆過程中，茶葉化學成分在微生物酶促作用和濕熱作用下發(fā)生一系列變化［2-3］。其中，微生物發(fā)酵過程中產生的水解酶起主導作用，從而促使黑茶在許多方面有別于綠茶、青茶和紅茶，表現為甘、醇、香等品質。這些品質是由于在黑茶發(fā)酵過程中微生物分泌的胞外酶作用于茶葉的大分子碳水化合物、蛋白質和單萜烯配糖體，分別分解成小分子糖、氨基酸和單萜烯醇化合物所帶來的［4］。另外，茶葉中的多酚化合物經微生物分泌的氧化酶作用轉化為茶黃素、茶紅素和茶褐素，使得黑茶茶湯擁有獨特的紅褐底色［5］。

【前人研究進展】普洱茶、茯磚茶、藏茶和六堡茶是我國黑茶產品的代表。黑茶發(fā)酵相關微生物的研究在普洱茶和茯磚茶中較多［6］。參與普洱茶發(fā)酵的微生物主要以黑曲霉（Aspergillus niger）為主［7］，而茯磚茶中主要以冠突散囊菌（Eurotium cristatus）為主［8］，其他的黑茶發(fā)酵微生物也主要以曲霉屬（Aspergillus）和散囊菌屬（Eurotium）真菌為主［9］。這些真菌在茶葉發(fā)酵過程中的生化代謝作用及其酶協(xié)同催化機制，已經引起茶業(yè)界的廣泛關注［6，10］。真菌利用茶葉作為培養(yǎng)基質產生多酚氧化酶、單寧酶和纖維素酶等酶類有較多的報道［11-14］。其中，以對黑茶發(fā)酵相關的優(yōu)勢真菌如黑曲霉和冠突散囊菌的胞外酶研究較多。曲霉屬真菌，包括黑曲霉，是產生和分泌蛋白酶、糖苷酶和脂肪酶的重要工業(yè)微生物［15］。鑒別平板檢測條件下，冠突散囊菌可以呈現果膠酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性［12］，而在液體發(fā)酵條件下，冠突散囊菌檢測到纖維素酶、多酚氧化酶、漆酶和蛋白酶［16］。近年來，采用組學技術對茶葉發(fā)酵過程中微生物群落和蛋白的動態(tài)變化作了初步分析［10,17-19］，從更為宏觀的角度揭示了蛋白和生物酶在茶葉發(fā)酵中的作用?！颈狙芯壳腥朦c】這些研究大多分析單一菌株的水解酶活性和自然條件下發(fā)酵茶的蛋白質組學特征，缺乏茶葉發(fā)酵過程中微生物胞外水解酶的系統(tǒng)分析，以及黑曲霉和冠突散囊菌產酶特性的比較。鑒于此，本研究挑選分離自中國不同產地黑茶中曲霉屬和散囊菌屬的9個菌株，分析和比較不同菌株產生胞外水解酶的能力?！緮M解決的關鍵問題】探究菌株之間產生胞外水解酶的差異，為綜合利用不同菌株創(chuàng)制人工混合菌種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試9個真菌菌株為FZ-2、LP-5、LP-9、PE-1、PE-3、XP-5、YA、JX和PE。菌株FZ-2、PE-1、LP-5、PE、YA和JX為散囊菌屬真菌，菌株PE-3、LP-9和XP-5為曲霉屬真菌。菌株由福建師范大學生命科學學院微生物實驗室保存于DG18斜面培養(yǎng)基中。其中，FZ-2分離自湖南產茯磚茶，LP-5和LP-9分離自廣西六堡茶，PE-1、PE-3、XP-5和PE分離自云南產普洱茶，YA和JX分離自四川產藏茶。供試9個菌株接種于DG18瓊脂培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株產胞外水解酶鑒別平板檢測 參照鄭麗等［20］和楊金梅等［18］的方法，采用固體培養(yǎng)基平板，分別檢測纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、淀粉酶、單寧酶和蛋白酶等6種水解酶的活性。

1.2.2 真菌孢子懸浮液的制備 將菌株PE-1和PE-3分別接種到DG18瓊脂培養(yǎng)基上活化，待菌落長滿整個平板后，取10～15 mL無菌水倒入菌落表面，用接種針刮取菌落表面的孢子，用1～5 mL移液槍將孢子懸液移入帶玻璃珠的無菌150 mL三角瓶中，充分振蕩以分散孢子，調整孢子懸浮液濃度為3×107～ 4×107個/mL，備用。

1.2.3 綠茶固態(tài)發(fā)酵 稱取10 g產自福建省寧德市的高山綠茶，放置于250 mL三角瓶中，加入10 mL蒸餾水，在115℃高壓滅菌30 min。在超凈工作臺中，分別吸取1 mL不同菌株的孢子懸浮液加入茶葉固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分晃動搖勻后，將該培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。

1.2.4 粗酶液制備 綠茶發(fā)酵完成后，在三角瓶中加入50 mL 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0），置于4℃、150 r/min搖床中浸提12 h。浸提液用8層紗布過濾，浸提液在4℃、10 000 r/min下離心10 min，除去沉淀，上清液即為粗酶液。

1.2.5 酶活性檢測 采用DNS法分別測定纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和淀粉酶的活力［20］；參照高琛等［13］的方法測定單寧酶活力；參照周景祥等［21］的方法測定蛋白酶活力。

1.3 數據分析

試驗數據采用IBM SPSS Statistics 19軟件進行分析與比較，并用Origin 85進行統(tǒng)計分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 鑒別平板檢測法比較不同菌株產水解酶能力

2.1.1 纖維素酶活力比較 纖維素酶鑒別培養(yǎng)基檢測結果見表1，菌株JX的d/D比值最大為1.93，與菌株LP-9相比差異不顯著，但極顯著大于其他菌株。散囊菌屬的菌株在纖維素酶鑒別培養(yǎng)基上生長受到限制，菌落較小。3株曲霉屬菌株生長較好，菌落擴展相對較快。供試9個菌株在纖維素酶鑒別平板上均能產生變色圈，初步判斷這些菌株都有產生纖維素酶的能力。

表1 不同菌株在纖維素酶鑒別培養(yǎng)基上產生的變色圈比較Table 1 Comparison of discoloration rings produced by different strains on cellulase plate

2.1.2 不同菌株產果膠酶能力比較 通過果膠酶鑒別培養(yǎng)基初步篩選出兩株產果膠酶的菌株PE-3和XP-5。產果膠酶的菌株在果膠酶鑒別培養(yǎng)基上生長后，其菌落周圍產生黃色水解圈；菌株PE-3和XP-5能夠很好地使添加了溴酚藍的果膠酶鑒別培養(yǎng)基由藍變黃。其他7個菌株在果膠酶鑒別培養(yǎng)基上未見明顯變色現象。

2.1.3 不同菌株產木聚糖酶能力比較 菌株在木聚糖酶鑒別培養(yǎng)基上生長后，如果有淺紫色變色圈產生，說明菌株能產生木聚糖酶。由表2可知，供試9個菌株均呈現顏色變化。其中，菌株PE-1在木聚糖酶鑒別培養(yǎng)基上生長的菌落最小，但其d/D比值最大、為1.23，極顯著大于其他菌株。菌株PE生長狀況較好，菌落直徑為63.17，變色圈直徑為70.17，說明其在木聚糖酶鑒別培養(yǎng)基上產酶能力和生長速度都較好。菌株LP-5、LP-9、PE-3和XP-5由于生長過程中分生孢子散落，產生許多小菌落和相應變色圈，無法準確測量其大小，需進一步通過其他方法測定其產木聚糖酶的能力。

表2 不同菌株在木聚糖酶鑒別培養(yǎng)基上產生的變色圈比較Table 2 Comparison of discoloration rings produced by different strains on xylanase plate

2.1.4 不同菌株產淀粉酶能力的比較 采用淀粉酶鑒別平板篩選，從9株供試菌株中初步篩選出7個菌株呈現淀粉酶活性（表3）。其中，菌株LP-5、LP-9在淀粉酶鑒別平板上生長情況較好，菌落生長速度較快，說明這兩株菌能很好地利用淀粉這一碳源；透明圈直徑也較大，說明菌株產淀粉酶的能力較其他菌株強。這些菌株中，菌株PE的d/D比值最大，與菌株JX、PE-1和YA相比差異顯著，與其他菌株相比差異不顯著。

表3 不同菌株在淀粉酶鑒別培養(yǎng)基上產生的透明圈比較Table 3 Comparison of transparent areas produced by different strains on amylase plate

2.1.5 不同菌株產單寧酶能力的比較 9個菌株在單寧酶鑒別平板上均分泌單寧酶，但產單寧酶的能力較弱，d/D比值均小于1.20（表4）。其中，菌株PE-3和XP-5在單寧酶鑒別平板上生長較快，在菌落周圍產生明顯的透明圈，說明這兩個菌株產單寧酶能力較強。但由于其生長過程中孢子散落，無法通過直接測量菌落直徑來與其他菌株比較產單寧酶能力，之后可進一步通過其他方法來測定其產酶能力。菌株PE和JX的d/D比值最小，菌落直徑和透明圈直徑基本重合，但從培養(yǎng)基背面觀察透明圈明顯，推測可能產胞內單寧酶。

表4 不同菌株在單寧酶鑒別培養(yǎng)基上產生的透明圈比較Table 4 Comparison of transparent areas produced by different strains on tannase plate

2.1.6 不同菌株產蛋白酶能力的比較 9個菌株在蛋白酶鑒別培養(yǎng)基上生長較快，說明菌株能很好地利用干酪素。通過蛋白酶鑒別平板僅篩選到1株產蛋白酶的菌株LP-9，菌落面積較大，透明圈較大且清晰。除菌株LP-9外，其他菌株未觀察到透明圈或透明圈不清晰。

2.2 酶活測定法比較不同菌株產水解酶能力

2.2.1 纖維素酶活力比較 菌株PE-1和PE-3的纖維素酶活力分別為3.09、6.84 U/mL（表5），菌株PE-3與菌株PE-1產纖維素酶活力存在極顯著性差異；在相同的茶葉固體發(fā)酵條件下，菌株PE-3分泌的纖維素酶較多，菌株PE-3產纖維素酶能力極顯著高于菌株PE-1。

2.2.2 果膠酶活力比較 酶活檢測結果（表5）顯示，菌株PE-3的果膠酶活力為12.51 U/mL，菌株PE-1則沒有測定到吸光值，菌株PE-1與菌株PE-3產果膠酶活力存在極顯著差異，說明在綠茶固體發(fā)酵的條件下，菌株PE-3分泌果膠酶，而菌株PE-1不分泌果膠酶。

表5 菌株PE-1和PE-3不同水解酶活力的比較Table 5 Comparison of different hydrolase activity of strains PE-1 and PE-3

2.2.3 木聚糖酶活力比較 菌株PE-1和PE-3的木聚糖酶活力分別為7.16、10.07 U/mL，菌株PE-3與菌株PE-1產木聚糖酶活力存在顯著差異（表5），表明在茶葉固體發(fā)酵條件下，菌株PE-3分泌的木聚糖酶較多。

2.2.4 淀粉酶活力比較 菌株PE-1和PE-3的淀粉酶活力分別為13.53、33.81 U/mL（表5），菌株PE-3產淀粉酶的能力極顯著高于菌株PE-1，表明菌株PE-3的淀粉酶分泌量明顯多于菌株PE-1。在淀粉酶鑒別平板上，菌株PE-3沒有觀察到菌落周圍有透明圈產生，而通過茶葉固體發(fā)酵后檢測到淀粉酶的存在，并且高于菌株PE-1的產量。

2.2.5 蛋白酶活力比較 菌株PE-1和PE-3的蛋白酶活力分別為2.50、0.50 U/mL，菌株PE-1與菌株PE-3產蛋白酶活力存在極顯著差異（表5）。但二者產蛋白酶酶活力都不強，與之前蛋白酶鑒別平板顯示的結果基本一致。

2.2.6 單寧酶活力比較 以綠茶作為發(fā)酵培養(yǎng)基，菌株PE-1和PE-3菌絲生長旺盛，產孢能力強。菌株PE-1和PE-3的單寧酶酶活力分別為132.09、68.93 U/mL（表5）。表明在茶葉固體發(fā)酵條件下，菌株PE-1產單寧酶的能力極顯著強于菌株PE-3。

3 討論

鑒別平板檢測和酶活性分析的結果顯示，曲霉屬菌株（PE-3、XP-5和LP-9）在分泌大分子碳水化合物水解酶（纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和淀粉酶）方面顯著強于散囊菌屬菌株；而散囊菌屬菌株在分泌蛋白酶和單寧酶方面則顯著強于曲霉屬菌株。纖維素、木聚糖和果膠是茶葉細胞壁的主要成分，淀粉是茶葉細胞質的重要成分，在水解酶作用下分解為小分子糖類，是茶水甘、醇滋味的主要貢獻者，也為茶葉發(fā)酵微生物提供碳素能源［4，6］。茶多酚是茶葉的特征性成分，是茶水特殊風味和生理功能的主要來源［3-4］。單寧酶在水解茶單寧，將茶葉中的酯型兒茶素水解轉化為非酯型兒茶素方面發(fā)揮重要作用［13］。而蛋白酶分解茶葉蛋白質產生的氨基酸，是茶水“鮮”味的主要來源［4］。已有的研究大多分析單一菌株純培養(yǎng)條件下的產酶能力，如丁婷等［11］、陳桂梅等［12］、顏正飛等［16］和楊金梅等［18］研究不同冠突散囊菌菌株的胞外水解酶，或研究普洱茶自然發(fā)酵過程中茶葉樣品中的水解酶活性［14，15，20，22-23］，難于體現不同微生物產酶能力的差異。在相同的培養(yǎng)條件下，曲霉屬和散囊菌屬的真菌產生的水解酶存在明顯差異，對底物有一定的選擇性，可能導致這兩個屬的真菌在利用培養(yǎng)基質方面存在差異。

在綠茶固態(tài)發(fā)酵條件下，菌株PE-1產生纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和單寧酶等5種水解酶，菌株PE-3產生本研究測試的全部6種水解酶。菌株PE-1在鑒別平板上沒有檢測到果膠酶和蛋白酶活性，固態(tài)發(fā)酵條件下沒有檢測到果膠酶活性。菌株PE-3在鑒別平板上沒有檢測到淀粉酶和蛋白酶活性，而在酶活測定條件下檢測到所有6種水解酶活性。因此，不同的培養(yǎng)基質和培養(yǎng)條件明顯影響真菌水解酶的產生和表達。在黑茶相關微生物酶活性檢測試驗中，已有的研究大多采用特定誘導底物和鑒別平板法檢測［11-13，16，18］；或以茶水作為誘導物，誘導微生物水解酶的產生［16］。鑒別平板法側重于酶活性的定性分析，靈敏度不夠，容易產生誤差［24］。茶水誘導在液體發(fā)酵條件下進行，與茶葉固態(tài)發(fā)酵條件也存在明顯差異。近年來，蛋白組分析技術應用于茶葉發(fā)酵過程中酶蛋白分析的研究逐漸增多［10，18-19］。蛋白組學分析可以從宏觀上了解微生物發(fā)酵過程中群體的酶活性表達情況，但難以說明不同微生物具體的產酶能力。采用鑒別平板檢測和酶活性分析相結合，以茶葉作為固態(tài)發(fā)酵基質，更加接近于生產實際；通過比較分析，可以更具體地說明菌株PE-1和PE-3的產酶能力和差異。

自然條件下，黑茶渥堆在混合菌的作用下完成［7-8，10，17］?；旌途l(fā)酵可以充分利用不同菌株的協(xié)同作用，提高微生物對發(fā)酵基質的利用效率；有些微生物代謝產物的產生在純菌發(fā)酵條件下難以實現，必須通過混合菌種的發(fā)酵才能完成［25-26］。菌株PE-1和PE-3是分離自普洱茶的真菌，菌株PE-1經初步鑒定為冠突散囊菌，而菌株PE-3鑒定為黑曲霉，分別代表我國黑茶產品中兩種與黑茶品質和風味關系密切的優(yōu)勢真菌［6-7］。黑曲霉PE-3產生的大分子碳水化合物水解酶（纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和木聚糖酶）酶活顯著高于冠突散囊菌；而冠突散囊菌PE-1分泌的蛋白酶和單寧酶活則顯著高于黑曲霉。黑曲霉和冠突散囊菌在茶葉發(fā)酵條件下胞外水解酶的種類和酶活的差異，暗示不同屬的真菌在利用有機質方面有選擇性，可能存在水解酶的協(xié)同催化作用。深入研究菌株PE-1和PE-3胞外酶活性和產酶條件，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件創(chuàng)制混合人工菌種，可為黑茶加工和標準化生產提供指導。

4 結論

從我國黑茶產品中分離的曲霉屬和散囊菌屬菌株，同一菌株可以分泌多種胞外水解酶，多個菌株也可以產生同一種水解酶，不同菌株產生胞外水解酶能力存在顯著差異。在茶葉發(fā)酵過程中，曲霉屬和散囊菌屬菌株分泌的水解酶具有對茶葉不同成分的選擇性，水解酶的協(xié)同作用可能影響菌株對茶葉成分的生物轉化和利用效率，從而影響黑茶的風味和品質。