段瑞軍，吳朝波 ，王 軍，黃圣卓，梅文莉，戴好富

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101；2.海南好授粉農(nóng)業(yè)科技服務(wù)有限公司，海南 樂(lè)東 570228；3.海南正和職業(yè)培訓(xùn)學(xué)校，海南 ?？?571101）

【研究意義】植物對(duì)鹽漬化生境的適應(yīng)實(shí)現(xiàn)方式主要通過(guò)滲透調(diào)節(jié)、肉質(zhì)化、離子區(qū)域化、鹽離子選擇性吸收及氣孔泌鹽等作用，其中滲透調(diào)節(jié)為主要方式，植物細(xì)胞中合成有機(jī)小分子溶質(zhì)為滲透調(diào)節(jié)的方式之一。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，植物積累脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖和多胺等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，行使其調(diào)節(jié)、保護(hù)、清除活性氧、促進(jìn)生長(zhǎng)等功能，在植物耐鹽性上具有重要作用［1］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.）葉片肉質(zhì)化、嬌嫩、較脆，富含葉酸、β-胡羅素、蛋白質(zhì)和多種微量元素，營(yíng)養(yǎng)豐富［2］，可在含鹽度與海水等同（含鹽度3.5%）的條件下正常生長(zhǎng)，是理想的鹽堿地推廣蔬菜，為理想的島礁蔬菜種植候選品種。目前關(guān)于冰菜的研究主要集中在栽培種植方面［3-4］，其生理生化方面僅有一些零星報(bào)道［5-6］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者所在課題組自引種冰菜在海南文昌鹽堿地試種以來(lái)，通過(guò)不同濃度海水處理所在課題表明，冰菜在0～100%濃度下均能完成生活史，但海水濃度高于60%冰菜生長(zhǎng)受到抑制，并對(duì)其抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行了研究［7］?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步摸清冰菜耐鹽生理機(jī)理，優(yōu)化了試驗(yàn)處理，測(cè)定不同濃度海水下膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（MDA）和細(xì)胞膜透性，獲取不同濃度海水下細(xì)胞膜的損傷情況，同時(shí)測(cè)定脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化，以期揭示冰菜有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與海水脅迫的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冰菜種子收集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所文昌試驗(yàn)基地，海水取自海口市白沙門(mén)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所進(jìn)行，2018年3月播種育苗，冰菜苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)進(jìn)行移栽，在前期研究基礎(chǔ)上設(shè)置5個(gè)濃度（20%、30%、40%、50%、60%）海水。移栽后一周進(jìn)行海水處理，每周澆2次。分3個(gè)時(shí)期（即出現(xiàn)一級(jí)分枝、二級(jí)分枝、三級(jí)分枝）采集相同部位葉片進(jìn)行MDA、細(xì)胞膜透性指標(biāo)和脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定。

MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法［8］，細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)率法［9］，脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮顯色比色法［10］；甜菜堿含量測(cè)定采用雷氏鹽沉淀法［11］，可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法稍作改進(jìn)［12］。

數(shù)據(jù)用Excel 2003整理，并繪制圖表；用SPSS13.0進(jìn)行方差分析和多重比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度海水對(duì)冰菜MDA含量和細(xì)胞膜透性的影響

逆脅迫下質(zhì)膜是首先受到攻擊的目標(biāo)之一，膜質(zhì)受到損傷，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加、膜透性增強(qiáng)。根據(jù)不同濃度海水下、不同生長(zhǎng)時(shí)期的冰菜MDA含量（圖1）可知，冰菜在20%濃度海水處理下，MDA含量最低。一級(jí)分枝和二級(jí)分枝MDA含量增長(zhǎng)規(guī)律一致，在20%～40%濃度海水處理下細(xì)胞中MDA含量積累無(wú)顯著增加，當(dāng)海水濃度≥40%時(shí)，細(xì)胞中MDA積累量顯著增加。濃度海水達(dá)到60%時(shí)，一級(jí)分枝、二級(jí)分枝中MDA含量分別是20%濃度的1.56、1.70倍。三級(jí)分枝中MDA含量在海水濃度為50%時(shí)達(dá)到最大，是20%濃度的2.56倍，之后呈下降趨勢(shì)。在相同海水濃度下，隨著冰菜生長(zhǎng)，MDA積累量不斷增加，且濃度越高，積累量越多，20%、30%、40%、50%濃度海水脅迫下，三級(jí)分枝MDA含量分別比一級(jí)分枝增加0.57、0.79、0.88、0.91倍。

圖1 海水脅迫對(duì)冰菜MDA含量的影響Fig. 1 Effects of seawater stress on MDA content of M. crystallinum L.

冰菜細(xì)胞膜透性結(jié)果（圖2）表明，相同海水濃度下，冰菜細(xì)胞膜受損傷程度為三級(jí)分枝＞二級(jí)分枝＞一級(jí)分枝，在20%、30%、40%、50%、60%濃度海水脅迫下細(xì)胞膜透性三級(jí)分枝分別是一級(jí)分枝的2.09、1.72、1.33、1.65、1.42倍；同一分枝在不同海水濃度脅迫下，細(xì)胞膜透性隨海水濃度增加而增強(qiáng)，冰菜細(xì)胞一級(jí)分枝、二級(jí)分枝、三級(jí)分枝膜透性在60%濃度海水脅迫下分別是20%濃度海水下的4.38、3.01、2.98倍。

圖2 海水脅迫對(duì)冰菜細(xì)胞膜透性的影響Fig. 2 Effects of seawater stress on cell membrane permeability of M.crystallinum L.

2.2 不同濃度海水對(duì)冰菜脯氨酸積累量的影響

脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，本試驗(yàn)將脯氨酸含量作為抗逆育種的重要生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，能降低凝固點(diǎn),可防止細(xì)胞脫水。由圖3可知，不同濃度海水處理對(duì)各級(jí)分枝的影響總體趨勢(shì)相似，脯氨酸含量在三級(jí)分枝中最高，其次為二級(jí)分枝，一級(jí)分枝中最少。當(dāng)海水濃度≤30%時(shí)，隨著海水濃度升高，脯氨酸含量增加，二級(jí)分枝較顯著。當(dāng)海水濃度≥30%時(shí)，隨著濃度海水增加，脯氨酸含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，二級(jí)分枝和三級(jí)分枝下降顯著。不同分枝中，30%濃度海水處理下脯氨酸含量升高顯著，其中二級(jí)分枝和三級(jí)分枝脯氨酸含量已超過(guò)25 μg/g。一級(jí)分枝脯氨酸含量在各濃度海水處理下變化沒(méi)有二級(jí)分枝和三級(jí)分枝明顯。

圖3 海水脅迫對(duì)冰菜脯氨酸含量的影響Fig. 3 Effects of seawater stress on proline content of M. crystallinum L.

2.3 不同濃度海水對(duì)冰菜可溶性糖積累量的影響

可溶性糖在冰菜生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，不僅為各時(shí)期提供能量和代謝中間產(chǎn)物，且具有信號(hào)功能，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。圖4所示，不同濃度海水處理在各級(jí)分枝呈現(xiàn)相同的影響趨勢(shì)，均隨著濃度海水升高，可溶性糖含量增加，且含量呈現(xiàn)三級(jí)階梯式顯著升高；各級(jí)分枝高濃度海水脅迫下，可溶性糖含量顯著高于低濃度處理，其中60%濃度海水處理下可溶性糖含量為20%處理的近2倍。不同濃度海水對(duì)一級(jí)分枝影響不如二級(jí)分支和三級(jí)分枝明顯，因?yàn)橐患?jí)分枝可溶性糖含量普遍較低，約為其他分枝的50%。

圖4 海水脅迫對(duì)冰菜可溶性糖含量的影響Fig. 4 Effects of seawater stress on content of soluble sugar of M. crystallinum L.

2.4 不同濃度海水對(duì)冰菜甜菜堿積累量的影響

圖5 海水脅迫對(duì)冰菜甜菜堿含量的影響Fig. 5 Effects of seawater stress on content of betaine of M. crystallinum L.

甜菜堿的積累對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡與細(xì)胞的正常生理活動(dòng)有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果表明：不同海水濃度下，當(dāng)海水濃度為20%～60%時(shí)，冰菜一級(jí)、二級(jí)分枝甜菜堿含量隨海水濃度的增加而增加，當(dāng)海水濃度為20%時(shí)，一級(jí)、二級(jí)分枝中甜菜堿含量分別為1 800、2 324 μg/g，當(dāng)海水濃度達(dá)60%，甜菜堿含量明顯增加，分別是20%海南濃度下的2.43、3.02倍。三級(jí)分枝中甜菜堿呈先增大后減小的趨勢(shì)，在40%海水濃度下達(dá)到最大值（7 455 μg/g），為20%、60%下的1.82、2.32倍。相同海水濃度下，在20%～60%濃度海水脅迫下，一級(jí)、二級(jí)分枝在相同濃度下甜菜堿含量均呈增加趨勢(shì)，60%濃度海水脅迫下冰菜一級(jí)、二級(jí)分枝甜菜堿積累量分別是20%濃度處理的2.27、2.29、2.05、1.53倍。60%濃度海水脅迫下，甜菜堿積累量二級(jí)分枝＞一級(jí)分枝＞三級(jí)分枝。

2.5 膜損傷指標(biāo)、有機(jī)小分子、海水間的相關(guān)性分析

分析不同海水濃度下各指標(biāo)相關(guān)性（表1）可知，海水濃度與膜損傷指標(biāo)細(xì)胞膜透性極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.972，與膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.957；海水濃度與甜菜堿含量呈正相關(guān)，其中與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與脯氨酸積累量呈負(fù)相關(guān)。電導(dǎo)率、MDA與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.966、0.963?？扇苄蕴欠e累與脯氨酸積累呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.907。綜合分析可知，有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖的積累能對(duì)膜損傷做出最快速的反應(yīng)。

表1 冰菜在海水脅迫下各試驗(yàn)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table1 Correlation analysis of various test indexes of M. crystallinum L. under seawater stress

2.6 海水脅迫與各有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)間在各生長(zhǎng)時(shí)期的相關(guān)性分析

由圖6A可知，冰菜一級(jí)分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈低度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.073；冰菜二級(jí)分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈中度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.651；冰菜三級(jí)分枝脯氨酸積累量與海水濃度呈高度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.894。即冰菜生長(zhǎng)期越長(zhǎng)，脯氨酸與海水脅迫的相關(guān)性越高。由圖6B可知，冰菜一級(jí)分枝可溶性糖積累量與海水濃度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.850；冰菜二級(jí)、三級(jí)分枝可溶性糖積累量與海水濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.966、0.955。即冰菜各生長(zhǎng)期時(shí)期、各海水濃度下，可溶性糖均能對(duì)海水脅迫做出響應(yīng)。由圖6C可知，冰菜一級(jí)分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.950；二級(jí)分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.906；三級(jí)分枝甜菜堿積累量與海水濃度呈低度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.015。即冰菜生長(zhǎng)前期，甜菜堿能及時(shí)為對(duì)海水脅迫做出響應(yīng)，隨著冰菜生長(zhǎng)，甜菜堿對(duì)海水脅迫響應(yīng)逐漸減弱。

圖6 海水濃度與脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的相關(guān)性分析Fig. 6 Correlation analysis of seawater concentration with proline, soluble sugar and betaine

3 討論

3.1 海水脅迫對(duì)冰菜細(xì)胞膜的損傷

逆境脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡遭到破壞，導(dǎo)致膜脂透性增大、膜脂過(guò)氧化物積累，使細(xì)胞膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損。研究發(fā)現(xiàn)，鹽濃度與細(xì)胞膜透性呈正比［13］。電解質(zhì)外滲率即電導(dǎo)率可以反映細(xì)胞膜透性，代表細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，細(xì)胞膜透性越大表明膜系統(tǒng)受損程度越大。對(duì)白刺的耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，3種白刺的電導(dǎo)率值均隨鹽脅迫增加而增大［14］；丙二醛是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，能與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而引起膜損傷［15］，其含量高低可間接表現(xiàn)植物受逆境脅迫的強(qiáng)弱。孫海菁等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在中低鹽度脅迫下細(xì)胞膜透性增加不明顯，而在高鹽度脅迫下迅速增加，與本研究結(jié)果一致。本研究表明，細(xì)胞膜透性、MDA均隨海水濃度增加而增加，在海水濃度為20%～60%范圍內(nèi)，一級(jí)、二級(jí)分枝均無(wú)明顯增加，海水濃度為50%時(shí)，各級(jí)分枝MDA含量、細(xì)胞膜透性均較20%下顯著增加。同一海水濃度下，生長(zhǎng)期越長(zhǎng)，細(xì)胞膜透性越大，膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累量越多，均呈現(xiàn)三級(jí)分枝＞二級(jí)分枝＞一級(jí)分枝的基本變化規(guī)律，表明，冰菜在20%～60%海水濃度范圍內(nèi)，具有極強(qiáng)的抗鹽性。

3.2 海水脅迫有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)

鹽脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)大量失水，導(dǎo)致滲透脅迫，為維持植物正常的生理代謝，通過(guò)滲透調(diào)節(jié)降低細(xì)胞水勢(shì)來(lái)吸收水分。脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于植物調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，消除或減輕鹽脅迫損傷，維持植物生長(zhǎng)。銀杏幼樹(shù)在鹽脅迫下，可溶性糖含量隨鹽濃度的升高和鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，脯氨酸含量在鹽脅迫后期顯著增加［17］，枸杞幼苗在鹽脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量在不同處理時(shí)期均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［18］，花椰菜苗期鹽脅迫下脯氨酸含量與鹽濃度極顯著正相關(guān)［19］，對(duì)薊幼苗NaCl脅迫下游離脯氨酸含量先增后減小［20］；不同牧草中可溶性糖含量變化不同，披堿草、草地早熟禾和星星草隨著鹽濃度的提高，可溶性糖含量呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，而老芒麥呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)［21］。鹽脅迫后胡楊根葉中甜菜堿濃度顯著提高，在處理后15 d達(dá)到最高值，特別是葉片中甜菜堿的濃度提高243倍，達(dá)到1 899.8μmol/L，根中甜菜堿含量也增加了9倍［22］?？梢?jiàn)，脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖在鹽脅迫下對(duì)植物抗鹽性具有重要作用，且各種植物中變化不一，但總的說(shuō)來(lái)，鹽脅迫下，上述滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均會(huì)不斷積累。本研究中，冰菜可溶性糖含量隨著海水濃度增加，積累量不斷增加，相同生長(zhǎng)階段，不同分枝中在60%濃度海水處理下可溶性糖含量為20%處理下的近2倍，同一海水濃度處理，可溶性糖含量三級(jí)分枝＞二級(jí)分枝＞一級(jí)分枝。說(shuō)明鹽脅迫時(shí)間越長(zhǎng)、脅迫濃度越大，可溶性糖含量越高。脯氨酸含量在各級(jí)分枝中均表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，表明脯氨酸能對(duì)低濃度海水脅迫做出響應(yīng)，隨著海水濃度增加，響應(yīng)程度降低。甜菜堿在冰菜生長(zhǎng)前期，即一級(jí)分枝、二級(jí)分枝表現(xiàn)為隨海水濃度增加，積累量增多，冰菜生長(zhǎng)至三級(jí)分枝時(shí)，甜菜堿積累量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)；在20%～50%濃度海水下，同一濃度海水處理冰菜隨著生長(zhǎng)期增長(zhǎng)，其體內(nèi)甜菜含量增加，表明甜菜堿在20%～50%海水處理下，能及時(shí)對(duì)鹽脅迫做出響應(yīng)。

3.3 海水脅迫與膜損傷指標(biāo)和有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的相關(guān)性

通過(guò)對(duì)MDA積累量、細(xì)胞膜透性、脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖與海水相關(guān)分析表明，膜損傷指標(biāo)MDA含量、膜透性與海水脅迫具有較高的正相關(guān)性，表明海水濃度增加對(duì)冰菜損傷作用增強(qiáng)。海水濃度與甜菜堿含量呈正相關(guān)，其中與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與脯氨酸積累量呈負(fù)相關(guān)；可溶性糖含量與細(xì)胞膜透性、MDA呈極顯著正相關(guān)。冰菜3個(gè)生長(zhǎng)期（一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)分枝）有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與海水脅迫的線(xiàn)性回歸分析結(jié)果表明，海水脅迫與冰菜生長(zhǎng)一級(jí)分枝呈顯著正相關(guān)，與二級(jí)、三級(jí)分枝呈極顯著正相關(guān)。海水脅迫與甜菜堿的積累量相關(guān)性在一級(jí)分枝為極顯著正相關(guān)，二級(jí)分枝為顯著正相關(guān)，三級(jí)分枝為低度負(fù)相關(guān)，表明隨著冰菜的生長(zhǎng)相關(guān)性逐漸降低，即冰菜生長(zhǎng)前期，甜菜堿在滲透調(diào)劑中起著重要作用。海水脅迫與脯氨酸含量呈負(fù)相關(guān)，且處理時(shí)間越長(zhǎng)負(fù)相關(guān)度越高，在三級(jí)分枝時(shí)呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，表明脯氨酸在鹽脅迫下隨著冰菜生長(zhǎng)其調(diào)節(jié)作用在減弱。

4 結(jié)論

隨著海水濃度增強(qiáng)，處理時(shí)間延長(zhǎng)，冰菜細(xì)胞膜內(nèi)膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA迅速積累，細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，而冰菜在20%～60%海水處理下依然能正常生長(zhǎng)，維持生物量，可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿均能做出不同程度的響應(yīng)，調(diào)節(jié)冰菜細(xì)胞滲透壓，維持冰菜正常生理活動(dòng)，促進(jìn)冰菜生長(zhǎng)。在參與滲透調(diào)節(jié)的有機(jī)小分子物質(zhì)中，與海水脅迫的相關(guān)性表現(xiàn)為可溶性糖＞甜菜堿＞脯氨酸。