石瑞文 哈妮 郭楠 張曉琴 關(guān)海濱

摘 要 從煉油廠廢水排放口附近污染較為嚴(yán)重的土壤樣本中馴化篩選、鑒定苯酚降解菌株，對(duì)該菌株在不同苯酚濃度下進(jìn)行降酚能力的考查。方法 采用以苯酚為唯一碳源、逐量分批的方法馴化、篩選苯酚降解菌株，利用形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)以及16SrDNA序列鑒定菌株。結(jié)果 篩選到一株苯酚降解菌株，鑒定為不動(dòng)桿菌屬，該菌株48h內(nèi)對(duì)苯酚（1.5g·L-1）的降解率為82.86%。結(jié)論 經(jīng)過馴化篩選和苯酚降解條件的優(yōu)化，所得苯酚降解菌株具有良好的苯酚降解能力。

關(guān)鍵詞 苯酚降解菌 馴化篩選 降解性能

中圖分類號(hào)：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

工業(yè)化程度的提高使許多工廠大量排放含酚廢水，水中生物的生存和飲用水水源質(zhì)量等都遭到極大的威脅。

生物法處理含酚廢水具有能耗少、處理效率高、二次污染少等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在從酚類污染物排放企業(yè)所排出的污泥以及被污染的土壤中篩選獲得高效降酚菌群并分離出單一高效降酚菌株，通過對(duì)獲得的高效降酚菌株降酚能力的考查、培養(yǎng)基的優(yōu)化以及鑒定分類，為相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)參考，為工業(yè)化處理含酚廢水提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基

（1）唯一碳源培養(yǎng)基：苯酚終濃度分別為0.1g·L-1至1.5g·L-1。

（2）富集培養(yǎng)基：蛋白胨10. 0g·L-1，牛肉浸膏5. 0 g·L-1，NaCl 5. 0 g·L-1，pH7. 0。

（3）富集（分離）固體培養(yǎng)基：苯酚濃度若干、瓊脂濃度為15.0 g·L-1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1苯酚降解菌的分離與純化

選取煉油廠廢水排放口附近污染較為嚴(yán)重的土壤，溶于無菌蒸餾水中，將其稀釋液涂布于含有苯酚的分離固體培養(yǎng)基梯度平板上。32℃培養(yǎng)36～48h。選取生長(zhǎng)在苯酚濃度較高區(qū)域并且形態(tài)較好的細(xì)菌單菌落，于分離固體斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2苯酚降解菌株的馴化、篩選

將1.2.1所得菌株接入含0.1 g·L-1苯酚的唯一碳源培養(yǎng)基中，32 ℃，pH7.0，150 r/ min 振蕩培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述培養(yǎng)過程，直至苯酚濃度達(dá)到1.5 g·L-1，選取單位時(shí)間內(nèi)降酚率較大的菌株。

1.2.3苯酚降解菌生長(zhǎng)量的測(cè)定及苯酚濃度的測(cè)定

以O(shè)D 600nm代表該菌體的生長(zhǎng)狀況，采用4-氨基安替吡林法測(cè)定苯酚濃度。

1.2.4苯酚降解率的計(jì)算

降解率（%） = （1-反應(yīng)后苯酚濃度/ 苯酚起始濃度） ？100 %

1.2.5苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查

選取不同培養(yǎng)溫度（T）、三角瓶裝量（V）、搖床轉(zhuǎn)速（v）等因素對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行單一條件及正交優(yōu)化。

1.2.6不同苯酚濃度下苯酚降解菌株的降酚能力考查

將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按5%的接種量接入含苯酚濃度分別為0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1的唯一碳源培養(yǎng)基中，32℃，pH7.0，150r·min-1培養(yǎng)，計(jì)算48h內(nèi)苯酚降解率。

1.2.7苯酚降解菌的鑒定

（1）傳統(tǒng)方法鑒定。通過降酚菌株的個(gè)體和菌落特征、生長(zhǎng)狀況、革蘭氏染色以及生理生化反應(yīng)初步鑒定該菌株。

（2）分子鑒定。設(shè)計(jì)細(xì)菌的16SrDNA序列通用引物，擴(kuò)增其16SrDNA序列，引物序列F1：5′CCCAAGCTTGGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，F(xiàn)2：5′CGGAATTCCGTACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，擴(kuò)增條件94℃、3min；（94℃、30sec；52℃、30sec；72℃、1 min）30個(gè)循環(huán)；72℃、5min；4℃保存，測(cè)序。

2結(jié)果

2.1苯酚降解菌株的分離篩選

經(jīng)過分離篩選，共挑取30株耐酚菌株，選取其中降酚率較高且遺傳穩(wěn)定的一株菌（HSG-18072313）作后續(xù)研究。

2.2苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查

菌株HSG-18072313最佳降解苯酚的培養(yǎng)溫度（T）、三角瓶裝量（V）、搖床轉(zhuǎn)速（v）分別為：30℃、50ml/250ml、150r·min-1。

2.3不同苯酚濃度下菌株HSG-18072313的降酚能力

48h內(nèi)對(duì)苯酚濃度為0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1降解率分別為93.28%、92.34%、89.56%、82.86%。

2.4菌株的鑒定

菌株HSG-18072313顯微形態(tài)為桿狀，菌落圓形，表面及邊緣光滑整齊，顏色為淺黃色，革蘭氏染色呈陰性。

利用blast軟件將菌株HSG-18072313的16SrDNA序列與Genebank中已報(bào)道的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明菌株HSG-18072313的16SrDNA序列與在Genebank登記的多株不動(dòng)桿菌屬的菌株具有高度的同源性（≥97%）。

結(jié)合顯微和菌落鑒定結(jié)果、生理生化反應(yīng)、分子鑒定，將HSG-18072313歸屬為不動(dòng)桿菌屬。

（通訊作者：關(guān)海濱）

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2018年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃校級(jí)項(xiàng)目（2018101320041）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2017年度本科教學(xué)工程和教育教學(xué)改革項(xiàng)目（NYJXGG2017022）。

作者簡(jiǎn)介：石瑞文（1981-），男，碩士研究生，講師；通訊作者：關(guān)海濱（1982-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：生物技術(shù)藥物。