摘 要：甲烷氧化菌是一類能以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行同化和異化代謝的細(xì)菌。本研究從污泥中分離、篩選獲得一株甲烷氧化菌MO-01，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化試驗和16S rDNA序列同源性分析，證實該菌株與Methylobacterium zatmanii菌株有99%的同源性，屬于Methylobacterium屬。甲烷氧化菌MO-01的實驗室培養(yǎng)條件篩選、研究表明，該菌株以甲烷為碳源，最佳培養(yǎng)溫度是37℃，最適PH值為7.0，銅離子濃度為30 umol/L。本研究為今后甲烷氧化菌的放大發(fā)酵培養(yǎng)和動物源性單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甲烷氧化菌;菌株篩選;菌種鑒定;16S rDNA

中圖分類號：Q-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

甲烷氧化菌（Methanotroph）是一種能夠以甲醇、甲烷、甲酸等作為生長所需的碳源以及能源的一種甲基氧化菌[1]。據(jù)科學(xué)測定，濕地系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的90%以上的甲烷氣體都會被甲烷氧化菌進(jìn)行氧化利用，用于合成自身細(xì)胞中的組成成分[2]。有研究表明甲烷氧化菌能夠用以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[3]。單細(xì)胞蛋白又稱微生物蛋白，是指從純培養(yǎng)的微生物細(xì)胞中提取得到的總蛋白，可作為人及動物蛋白的補充[4]。研究已經(jīng)表明，使用微生物產(chǎn)生的單細(xì)胞蛋白安全無毒，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和多種維生素，可以用作飼料促進(jìn)畜禽生產(chǎn)，提高飼料利用率，代替魚粉、大豆、骨粉、肉類和脫脂奶粉等蛋白補充飼料，具有較高的附加值[5]。由細(xì)菌以甲烷為原料生產(chǎn)的新型單細(xì)胞蛋白的蛋白含量69%～80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于工業(yè)生產(chǎn)飼料15%～20% 的蛋白含量，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的市場空間[6-7]，因此分離出能以甲烷為碳源生長的甲烷氧化細(xì)菌有著重要的意義。

本研究從污泥中分離了一株能夠以甲烷為碳源和能源的菌株，并對其生物學(xué)性狀進(jìn)行研究，利用16S rDNA技術(shù)對篩選的菌株進(jìn)行鑒定，并利用單因子控制的方法對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，為后期進(jìn)一步放大發(fā)酵培養(yǎng)和甲烷單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)提供良好科學(xué)依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"材料

1.1.1"篩菌土樣

篩菌土樣采集于河床淤泥和生活垃圾填埋場5年以上填埋區(qū)土壤。

1.1.2"初篩選及富集培養(yǎng)基

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：Mg SO4·7H2O 0.2 g、 KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、（NH4）2SO4 1.0 g、NaCl 1.0 g。以甲烷作為富集培養(yǎng)基碳源，以0.5 %無水甲醇作為固體培養(yǎng)基碳源;單一碳源無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基向上述液體培養(yǎng)基中加入1.5%～2%瓊脂。所有培養(yǎng)基配方及配置均由中國藥科大學(xué)微生物教研室提供。

1.2"方法

1.2.1"甲基氧化菌的富集培養(yǎng)

稱取土樣10.0 g，加入到帶玻璃珠的裝有100 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，30 ℃搖床震蕩30 min，靜置10 min，得到土樣浸出液。取1.0 mL土樣浸出液上清加入到裝有90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液的100 mL鹽水瓶中，用50升注射器注入甲烷氣體。隨后將鹽水瓶置于恒溫?fù)u床中在150 r/min，30 ℃條件下富集培養(yǎng)，直至錐形瓶中培養(yǎng)液明顯紅色渾濁。選取出現(xiàn)紅色渾濁較快且渾濁度較高的樣品組用于目的菌株的篩選[8]。

1.2.2"甲烷氧化菌的分離純化

甲烷氧化菌同樣能利用甲醇，因此在分離純化甲烷氧化菌時以甲醇代替甲烷制備固體培養(yǎng)基。以重復(fù)富集3次后獲得的粉紅色富集培養(yǎng)液為材料，采用平板分區(qū)劃線的方法將富集培養(yǎng)液接種于含0.5%甲醇的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10天，挑取平板上的粉紅色的單菌落接種于新的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次，獲得的純化的菌株即為甲烷氧化菌。

1.2.3"分離菌株的生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1"生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對獲得的甲基氧化菌MO-01進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色、運動性、生理生化鑒定[9]。

1.2.3.2"16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和1492R（5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對提取純化后的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并利用NCBI的Blast，將測序結(jié)果與Genbank中公開的16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4"甲基氧化菌MO-01培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選

1.2.4.1"初始pH值對甲基氧化菌MO-01生長的影響

將目的菌株接種于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，設(shè)定初始pH分別為4、5、6、7、8、10，37℃搖床培養(yǎng)96 h后570 nm測定菌液OD值。

1.2.4.2"溫度對甲基氧化菌MO-01生長的影響

將菌液接種于pH7.0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，實驗選取了20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃ 六個溫度下對目的菌株進(jìn)行搖床培養(yǎng)后測定菌液OD570值。

1.2.4.3"銅離子濃度對甲基氧化菌MO-01生長的影響

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入濃度為0、5、10、20、30、40 umol/L的CuSO4， 37℃，150 rpm搖床培養(yǎng)96 h后測定菌液OD570值。

1.2.4.4"不同碳源對甲基氧化菌MO-01生長的影響

分別用麥芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作為碳源，加入上述無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)96 h后570 nm測定菌液OD值。

2"結(jié)果與分析

2.1"甲烷氧化菌MO-01形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定

通過富集培養(yǎng)、利用平板分區(qū)劃線、轉(zhuǎn)接等方法從污泥中分離出10株能夠利用甲烷的細(xì)菌，其中一株在單位時間內(nèi)消耗甲烷能力最強、生長速度較快，命名為甲烷氧化菌MO-01，對MO-01形態(tài)學(xué)和生理生化試驗，該菌在以甲醇為碳源的瓊脂平板上經(jīng)48 h培養(yǎng)后菌落為粉紅色，表面光滑，菌落邊緣整齊，直徑0.8～1.2 mm，革蘭氏陰性短桿菌、無芽孢、無莢膜，在液體培養(yǎng)基中呈粉紅色菌液（圖1）。甲烷氧化菌MO-01產(chǎn)H2S試驗、吲哚試驗為陰性;甲基紅試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗和明膠液化試驗均為陽性。

對甲烷氧化菌MO-01進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增并測序，堿基長度為1 427 bp，與GenBank中公開的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，BLAST結(jié)果顯示，MO-01的16S rDNA基因序列與Methylobacterium zatmanii 7211菌株的同源性最高（圖2），達(dá)99%，所以確定該菌為甲基桿菌屬?；?6S rDNA序列、生化鑒定以及表征性狀，確定該分離菌株MO-01為甲基桿菌屬。

2.2"初始pH值對甲烷氧化菌MO-01生長的影響

對不同pH值條件下甲烷氧化菌MO-01生長情況進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示，MO-01在pH值

4-5時幾乎停滯生長，隨著pH值升高，生物量增加，到達(dá)7.0時最高，隨后隨著pH值升高，生物量有所下降，表明菌株MO-01最適生長pH值=7.0，屬中性培養(yǎng)菌。而國內(nèi)鄧永翠[10]從青藏高原濕地分離了2株酸性甲烷氧化菌，江皓[11]等從煤礦土壤中分離的甲烷氧化菌呈堿性。因而甲烷氧化菌的最適PH值大小應(yīng)該與分離菌所在的環(huán)境酸堿條件相關(guān)。

2.3"溫度對甲烷氧化菌MO-01生長的影響

在液體培養(yǎng)基pH值為7.0時，研究溫度對MO-01生長的影響，如圖4所示，OD值在37℃時為最高，說明甲烷氧化菌MO-01的最適生長溫度為37℃，在37～40℃溫度范圍內(nèi)，細(xì)菌的生長量都比較高，隨后隨著溫度升高而下降。這與趙艮貴[12]等人報道的最適溫度15～30℃有較大差異，可能與分離菌的原始生長條件有關(guān)。

2.4"銅離子濃度對甲烷氧化菌MO-01生長的影響

如圖5所示，銅離子適量添加，對甲烷氧化菌

MO-01生長有明顯的促進(jìn)作用，在30 umol/L CuSO4·5H2O添加量時，細(xì)菌的生物量達(dá)最高，但隨后又隨著添加量的增加而降低。表明MO-01的生長明顯受銅離子的調(diào)控。這與王曉麗[13]等報道的基本一致。

2.5"不同碳源對甲烷氧化菌MO-01生長的影響

分別用0.5%的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉和甲醇作為碳源研究甲烷氧化菌MO-01對碳源的利用能力，結(jié)果如圖6所示，甲烷氧化菌MO-01對所提供的碳源都能利用，對淀粉的利用率最低，對甲醇最高。這與國內(nèi)劉曉寧[14]等以甲醇為唯一碳源時，菌株生長很快但菌體生物量較低的報道不一致，可能與分離菌本身固有的特性相關(guān)。

3"結(jié)論

本研究從兩類土壤樣品中分離出10株甲烷氧化菌，其中一株甲烷利用能力較強，革蘭氏陰性，這與目前已有報道的甲烷氧化菌都為革蘭氏陰性菌且沒有芽孢這一結(jié)果一致[15]。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化實驗與16S rDNA生物學(xué)鑒定，該菌屬于Methylobacterium屬細(xì)菌，并命名為MO-01。

通過MO-01菌的分離純化、最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選研究，結(jié)果表明，MO-01菌在37℃、pH值70、銅離子濃度30 umol/L時生物量達(dá)到最大，為最適培養(yǎng)條件。

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（責(zé)任編輯：于慧梅）

Isolation， Identification of Methanotrophic Bacteria and

Optimization of its Fermentation Conditions

GU Huabing1， SHEN Yang2， ZHOU Shuxin3， FAN Jianghua1， LI Shangmin1，

WU Zhaolin1， JIN Bo1， "CHU Weihua3*

（1.Jiangsu Institute of Poultry Sciences，Yangzhou 225125， China; 2.Yangshe Animal Epidemic Prevention Staion， Zhangjiagang 215637， China;

3. China Pharmaceutical University， Nanjing "210009， China）

Abstract：

Methanotrophs are a kind of bacteria which can use methane as the sole carbon source and energy for their anabolism and catabolism. A strain of methyl oxidizing bacteria was isolated ，named MO-01，and screened by its morphology， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence homology analysis.The results showed the MO-01 strain had 99% homology with the Methylobacterium zatmani strain， and was proved to belong to the genus Metylobacterium.The strain of the optimum growth condition was PH 7.0，and copperion concentration was 30 umol/L.This experiment laid a good foundation for the amplification of the Mo-01 strain ，and the production of single￣cell protein.

Key words：

methanotrophs bacteria; screening; identification; 16S rDNA