陸蕓瑤 王 卉 喻 垚 李光新 吳立翔 郭變琴

乳腺癌是起源于乳腺組織的一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，病死率居全球癌癥病死率的第5位[1]?，F(xiàn)臨床上常用乳腺鉬靶X線攝影篩查乳腺癌，但頻繁的篩查顯著提高了疾病假陽性率(>20%)，增加了受檢女性的心理負(fù)擔(dān)并且其對健康女性的長期影響還未明確[2]。臨床上根據(jù)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的含量等輔助診斷乳腺癌，但其敏感度低、特異性差，不能有效篩查早期癌癥及原位癌，而且部分檢測結(jié)果相同的乳腺癌患者其臨床表現(xiàn)差異較大[3]。所以有必要研究更加敏感的診療因子，用以乳腺癌的早期診斷及高患病風(fēng)險人群的識別。

microRNA(miRNA)是一類18～22個核苷酸組成的非編碼RNA,其表達(dá)存在組織特異性、穩(wěn)定性高、檢測可重復(fù)性強(qiáng)。多個研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者組織及血漿中存在特異表達(dá)的miRNA,提示miRNA可以作為一種新的腫瘤診療標(biāo)志物[4]。

miR-21和miR-210在胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、腸癌和卵巢癌等多種癌癥中高表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個過程[5]。miR-21和miR-210在乳腺癌中的研究相對較少，對乳腺癌的診斷價值還未有明確定論。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR方法檢測miR-21和miR-210在乳腺癌組織和血漿中的含量，同時應(yīng)用ROC曲線評價其在乳腺癌中的診斷價值以及通過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析其與患者預(yù)后的關(guān)系,旨在探尋一種用于乳腺癌早期診斷及預(yù)后評價指標(biāo)。

材料與方法

1.材料：收集2016～2017年在重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理學(xué)確診的乳腺癌患者腫瘤組織及血漿標(biāo)本。其中，乳腺癌患者腫瘤組織標(biāo)本31例，患者平均年齡52.84±8.57歲；另取癌旁組織36例作為正常對照組，平均年齡40.89±12.27歲。乳腺癌血漿樣本25例，平均年齡47.36±11.72歲；另隨機(jī)選取筆者醫(yī)院體檢健康女性血漿樣本21例作為正常對照，平均年齡41.57±9.80歲。患者基本情況詳見表1。本研究獲得重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且所有患者均簽署知情同意書。

表1 患者基本情況

2.主要試劑與儀器設(shè)備：(1)主要試劑：miRcute miRNA提取分離試劑盒、血清/血漿miRNA提取分離試劑盒、石蠟包埋組織切片miRNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-21、miR-210及內(nèi)參U6的特異性莖環(huán)引物購自美國Genecopoeia公司，SYBR@PremixExTaq試劑盒購自寶生物工程有限公司。(2)儀器設(shè)備：CFX-Connect熒光定量PCR儀、T100 Thermal Cycler 梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)，NANODROP 1000核酸濃度測定儀、FRESCO17高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)。

3.研究方法：(1)miRNA提取：取新鮮冷凍的乳腺組織20～25mg，液氮中進(jìn)行研磨；轉(zhuǎn)移石蠟切片1～8片至離心管中；取收集的抗凝血，離心后獲得上層血漿。分別參照相應(yīng)miRNA提取試劑盒說明書提取miRNA，檢測miRNA的A260/A280比值及濃度。(2)實(shí)時熒光定量PCR：取100ng RNA，參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR@Premix Ex Taq試劑盒檢測miR-21、miR-210的含量：SYBR@Premix Ex Taq 12.5μl(2×)，qPCR Forward Primer 0.5μl，qPCR Forward Primer 0.5μl，cDNA(稀釋5倍) 2μl，Nuclease-free water 9.5μl。反應(yīng)條件: 95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，45個循環(huán)。

結(jié) 果

1.乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21、miR-210含量：采用熒光定量PCR檢測miR-21、miR-210在31例乳腺癌腫瘤組織和36例癌旁正常組織(對照組)中的含量，結(jié)果顯示，與癌旁正常組織比較,miR-21在乳腺癌腫瘤組織中含量顯著升高 (P=0.011，圖1A)；而miR-210的含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.193，圖1B)。

圖1 乳腺癌患者腫瘤組織中miRNA的含量

2.乳腺癌患者血漿中miR-21、miR-210含量：采用熒光定量PCR檢測miR-21、miR-210在25例乳腺癌患者血漿和21例健康者血漿(對照組)的含量。結(jié)果顯示，與對照組比較,miR-21、miR-210在乳腺癌患者血漿中的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.874，P=0.457，圖2)。

圖2 乳腺癌患者血漿中miRNA的含量

3.miR-21診斷乳腺癌的ROC曲線：繪制ROC曲線, 評價miR-21在乳腺癌中的診斷價值, ROC曲線下面積趨近于1, 該指標(biāo)對疾病的預(yù)測價值越高。miR-21的AUC=0.695(圖3), miR-21在乳腺癌的診斷中具有一定的作用。

圖3 組織miRNA-21輔助診斷乳腺癌的ROC曲線

4.miR-21的含量與乳腺癌患者生存曲線分析：通過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析miR-21與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-21高含量組生存時間明顯低于miR-21低含量組，經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。

圖4 乳腺癌患者miR-21含量-生存曲線

討 論

乳腺癌是全球女性癌癥患者中最常見的癌癥，每年全球的新增病例超過100萬例。乳腺癌導(dǎo)致的女性病死率居癌癥相關(guān)病死率的第2位[6,7]。所以研究更加敏感的乳腺癌早期診斷腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。miRNA可以作為診斷標(biāo)志物的基礎(chǔ)是miRNA在患病組織及血液中存在特異的穩(wěn)定的表達(dá)。

miRNA-21在多個實(shí)體瘤(前列腺癌、直腸癌、肺癌等)中的表達(dá)均上調(diào)，參與多個腫瘤抑制基因(PTEN、PDCD4、p53等)的調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞的生長、入侵和轉(zhuǎn)移等有關(guān)[2]。在乳腺癌中，miR-21參與癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8]。有研究報道m(xù)iR-21在乳腺癌患者組織中表達(dá)上調(diào)， miR-21 的含量和激素水平及疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、ROC曲線等相關(guān)[2]。另有研究報道血漿中miR-21的含量和激素水平及疾病分期無關(guān)[9]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21的含量顯著高于對照組，而血漿中miR-21的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明組織中miR-21可作為乳腺癌診斷腫瘤標(biāo)志物, 后續(xù)仍需大量的標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。為了進(jìn)一步研究miR-21對乳腺癌的診斷價值，筆者進(jìn)行了ROC曲線分析，AUC作為評價指標(biāo)，AUC越大說明診斷效果更好。ROC曲線下面積為0.695，表明組織中miR-21的含量可作為乳腺癌診斷有效指標(biāo)。另外，筆者還使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析了miR-21的生存曲線，發(fā)現(xiàn)miR-21高含量組生存時間明顯少于miR-21低含量組，說明miR-21含量的高低和乳腺癌預(yù)后相關(guān)。

有研究表明，miR-210在乳腺癌患者血漿中含量升高,筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳腺癌腫瘤組織、血漿中miR-210的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義, miR-210在腫瘤組織與血漿結(jié)果相一致,均未升高[5]。與文獻(xiàn)報道不一致的原因可能為各實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程的不同造成結(jié)果的差異, 因?yàn)椴煌臉?biāo)本會影響miRNA的表達(dá)，如標(biāo)本的種族差異、標(biāo)本量、對照組的選擇等, 對于血漿標(biāo)本而言，抗凝劑的不同、新鮮血液標(biāo)本還是凍存血液標(biāo)本、標(biāo)本是否存在肉眼不可見的溶血、脂血等也會影響miRNA的表達(dá)。不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)同樣會影響miRNA的表達(dá)，如miRNA提取方式、內(nèi)參的選擇、檢測方法的不同, 離心的轉(zhuǎn)速、RNA濃度的檢測這些都會影響miRNA的表達(dá)[10，11]。

此外, 由于腫瘤患者血漿中的miRNA主要來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡，應(yīng)激、炎癥及遷移等導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞損傷后miRNA的釋放, 不同病理狀態(tài)下，miRNA被選擇性地釋放到血漿中, 因此標(biāo)本采集的時間點(diǎn)對于結(jié)果的影響非常大[12，13]。另有研究報道，miRNA不僅可作為癌癥的血漿腫瘤標(biāo)志物，也可以作為其他疾病的標(biāo)志物 (如miR-21 、miR-210在腸炎、潰瘍、心血管系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、糖尿病等疾病中存在差異表達(dá)), 收集單純患有乳腺癌的標(biāo)本難度極大[14]。以往的研究包括筆者的研究中收集的患者大多患有一些心血管系統(tǒng)、糖尿病等疾病, 這些不同的疾病狀態(tài)可能會影響miR-21、miR-210在血漿中的表達(dá)。miRNA的表達(dá)也極易受到患者飲食習(xí)慣、生活方式等的影響，即使一個小小的靜脈穿刺也有可能影響其表達(dá)[11，15]。

總之, 由于血漿中miRNA的含量受多因素影響， 因此選取血漿miRNA作為腫瘤標(biāo)志物還需要制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程, 如:樣本收集、處理、檢測方法的選擇、參考區(qū)間的確定等。多個miRNA聯(lián)合檢測比單個miRNA檢測更敏感，選擇哪些miRNA作為生物學(xué)標(biāo)志物需要開展大量實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。